轉(zhuǎn)TrxS基因啤酒大麥的分子檢測和表達分析.pdf

1、大麥是釀造啤酒的主要原料。隨著我國啤酒產(chǎn)量的逐年增加，大麥使用量也成比例增加。從2002年起，我國成為世界啤酒第一生產(chǎn)大國，但國產(chǎn)啤酒大麥的生產(chǎn)和供應相對滯后，主要原因之一在于國內(nèi)啤酒大麥在數(shù)量和質(zhì)量上都不能滿足啤酒工業(yè)的要求。目前我國啤酒大麥年需求量為300-350萬噸，而國產(chǎn)啤酒大麥只有100多萬噸，啤酒工業(yè)所需的啤酒大麥70％來自國外進口，我國已成為世界上最大的啤酒大麥進口國。啤酒大麥長期依賴進口，不僅影響啤酒企業(yè)健康的發(fā)展，而且

2、受制于人。因此，只有發(fā)展國內(nèi)啤酒大麥生產(chǎn)，啤酒工業(yè)的發(fā)展才能有可靠保證。 應用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行大麥品質(zhì)改良是大麥育種的一個新途徑。近年來，國外有關硫氧還蛋白h(Trxh)的研究，為應用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行大麥品質(zhì)改良提供了可能。Trxh通過還原靶蛋白中的二硫鍵(S-S)，在許多反應中起著至關重要的作用，參與細胞的各種代謝活動。研究表明，在種子發(fā)芽過程中，Trxh能促進淀粉酶的活性提高，增加貯藏蛋白的水溶性，使種子中的貯藏營養(yǎng)物質(zhì)更易于水

3、解以促進胚乳中的碳氮代謝。而啤酒大麥品質(zhì)的評價指標如發(fā)芽勢、發(fā)芽率、麥芽浸出率、糖化力等，與大麥種子淀粉酶和蛋白酶活性關系密切。因此，Trxh活性的高低與啤酒大麥品質(zhì)之間有一定的相關關系。增加種子中Trxh的活性，有望改善大麥品質(zhì)。來源于藍色黑鴨草的TrxS基因，與硫氧還蛋白h基因有顯著的同源性，兩者的蛋白表達產(chǎn)物有相似的生物活性，具有硫氧還蛋白h的功能。將TrxS基因?qū)肫【拼篼溒贩N中，有望提高種子中的Trxh活性，為大麥品質(zhì)改良提供

4、新途徑。 本研究對獲得的轉(zhuǎn)TrxS基因啤酒大麥材料進行了分子檢測、遺傳分析和大麥籽粒生理生化特性測定，從分子水平上驗證了目的基因已整合在大麥基因組中，并能夠穩(wěn)定遺傳；目的基因在轉(zhuǎn)基因啤酒大麥中能夠正常轉(zhuǎn)錄和表達，并對目的基因的漂移和轉(zhuǎn)基因大麥的品質(zhì)性狀等進行了研究。主要研究結(jié)果如下： 1.獲得轉(zhuǎn)TrxS基因啤酒大麥新品系 利用PCR、巢式PCR和PCR-Southern雜交等技術(shù)對轉(zhuǎn)基因啤酒大麥豫啤1號、晉引6號

5、和國外品種Harrington、Franklin后代植株進行檢測，均檢測到陽性植株。其中，豫啤1號、Franklin、Harrington的T1代PCR陽性檢測率分別為50.6％、61.2％和67.3％；目的基因在不同材料中的遺傳行為不同，外源基因在Harrington、晉引6號中是以單拷貝的形式整合在大麥基因組上，并能夠穩(wěn)定地遺傳給后代；Franklin和豫啤1號部分株系符合3：1的比例，但在后代自交過程中，外源基因發(fā)生丟失。經(jīng)PCR

6、跟蹤檢測與分析，得到純合的轉(zhuǎn)基因大麥新品系，為進一步進行外源基因的表達與功能研究奠定了基礎。 2.初步明確了轉(zhuǎn)TrxS基因在啤酒大麥中的作用機理 實時熒光RT-PCR檢測表明目的基因?qū)氪篼満?，在RNA水平上能夠正常表達；對轉(zhuǎn)基因啤酒大麥籽粒中相關生理生化性狀研究分析結(jié)果表明：在種子發(fā)芽過程中轉(zhuǎn)基因大麥種子的Trxh活性顯著高于對照；種子發(fā)芽1-5d，轉(zhuǎn)基因種子α-淀粉酶的活性比對照分別增加了5.86％、75.24％、1

7、18.51％、71.02％和22.99％；β-淀粉酶活性比對照分別增加19.29％、14.68％、35.47％、23.62％和2.67％；轉(zhuǎn)基因大麥種子儲藏淀粉降解明顯加快，第二天和第三天轉(zhuǎn)基因種子的淀粉含量分別比第一天下降了3％和14％，而對照種子比第一天分別下降了1％和7.4％；轉(zhuǎn)基因種子的蛋白酶活性顯著高于對照，貯藏蛋白的降解速度加快；轉(zhuǎn)基因種子的發(fā)芽勢明顯高于對照。說明轉(zhuǎn)基因通過提高水解酶的活性，加速種子貯藏物質(zhì)的分解，改善種子

8、的碳、氮代謝過程，進而促進種子萌發(fā)，提高麥芽產(chǎn)量，為TrxS基因的利用提供了理論依據(jù)。 3.轉(zhuǎn)TrxS基因可以改善大麥麥芽品質(zhì) 經(jīng)品質(zhì)分析，轉(zhuǎn)基因大麥的糖化力、α-氨基氮和可溶性氮分別比對照提高了15％、11％和2.4％，麥汁過濾速率比對照提高了10.52％，說明外源TrxS基因的導入，對大麥麥芽品質(zhì)有改進作用。同時，通過轉(zhuǎn)基因小麥面粉的毒性分析，TrxS基因轉(zhuǎn)化后是無毒性的。 4.大麥優(yōu)異種質(zhì)的創(chuàng)育 通

9、過分子標記輔助選擇技術(shù)，將TrxS基因?qū)氲酱篼湻N質(zhì)資源中，獲得了含有TrxS的雜交后代，為大麥新品種選育提供了優(yōu)良親本。此外，轉(zhuǎn)TrxS基因可使大麥成熟提前2天，對大麥其它農(nóng)藝性狀無顯著影響；由于大麥特殊的開花習性，TrxS基因在較小的范圍內(nèi)有漂移，并與風向有一定的關系。 綜上所述，通過對轉(zhuǎn)基因啤酒大麥的分子檢測和遺傳分析，獲得了轉(zhuǎn)基因大麥新品系，同時證明了目的基因在轉(zhuǎn)基因大麥中能夠正常表達，并且改善了種子的碳氮代謝，有利于改