棉屬野生種旱地棉(Gossypium aridum)耐鹽相關(guān)基因的分離與鑒定.pdf

1、目前全球受鹽堿化影響的耕作土地約占世界總耕地面積的20％，然而由于全球氣候的變化及不合理的灌溉方式，使這一數(shù)字有進(jìn)一步擴大的趨勢。棉花是世界上最重要的纖維作物和油料作物之一，屬中等耐鹽作物，是鹽堿地先鋒作物，但當(dāng)土壤含鹽量超過0.3％時，棉花的生長發(fā)育就會受到嚴(yán)重的抑制。由于現(xiàn)有棉花栽培品種耐鹽水平總體不高，而且基礎(chǔ)種質(zhì)相對集中，使棉花在鹽堿地的推廣受到極大限制。棉屬野生種種質(zhì)資源豐富，且包含眾多優(yōu)異等位基因。前人報道D染色體亞組的旱地

2、棉(Gossypium aridum)具有較強的耐鹽性。本研究以棉屬野生種旱地棉為材料，以鹽敏感栽培種蘇12為對照，通過對野生種鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄組的分析，鑒定與棉花野生種旱地棉耐鹽相關(guān)基因，分析各基因在鹽脅迫下可能起到的作用，探討棉屬野生種的耐鹽性機理。研究結(jié)果如下:
　　 1.利用cDNA-AFLP技術(shù)分離出了旱地棉/戴維遜氏棉鹽脅迫下的25個表達(dá)差異片段(TDFs)。利用電子克隆方法，將這些差異片段與棉花已知EST序列進(jìn)行拼接

3、。拼接結(jié)果經(jīng)NCBI中Blast程序分析表明，大部分片段都與植物抗逆基因同源，其中與代謝過程相關(guān)的基因片段所占比例最大，為24％，與細(xì)胞生長發(fā)育相關(guān)基因，膜蛋白基因及滲透調(diào)節(jié)基因同源的片段次之，各占12％，與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因，轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，轉(zhuǎn)運蛋白基因及未知基因同源的片段，各占8％，與活性氧清除及具有大分子保護(hù)功能的基因同源的片段最少，各占4％。利用半定量RT-PCR鑒定了其中9個TDFs在旱地棉不同組織及經(jīng)不同鹽脅迫時間下的葉片中表達(dá)

4、情況。結(jié)果表明大部分基因片段都受到鹽脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，部分TDFs有較強的組織差異表達(dá)特性。
　　 2.利用電子克隆技術(shù)及GenomeWalking技術(shù)獲得了旱地棉三個耐鹽相關(guān)全長基因，機械敏感離子通道類蛋白（GarMSL），細(xì)胞色素類蛋白（GarCYP），蘇氨酸醛縮酶類蛋白(GarTHA)。GarMSL基因編碼707個氨基酸，理論分子量78.26kDa，與擬南芥AtMSL2基因同源率為60.92％;其基因組結(jié)構(gòu)包含13個外顯子和

5、12個內(nèi)含子;根據(jù)其內(nèi)含子中SSR分析結(jié)果，GarMSL基因在A，D基因組內(nèi)各有一個拷貝;啟動子區(qū)域包含赤霉素，及茉莉酸響應(yīng)調(diào)控元件;蛋白結(jié)構(gòu)分析表明該蛋白包含5個跨膜區(qū)域。GarCYP基因編碼509個氨基酸，與楊樹PtCYP98A27基因同源率為88.61％，理論分子量為57.80kDa，啟動子序列分析表明GarCYP基因啟動子區(qū)包含乙烯響應(yīng)元件（ERE），水楊酸響應(yīng)元件(TCA-element)。GarTHA基因在第6個外顯子區(qū)域存

6、在可變剪切機制，GarTHA1基因編碼358個氨基酸，38.19kDa，GarTHA2編碼273個氨基酸，28.75kDa。根據(jù)同源基因AtTHA1基因在ATTED及eFP中的分析結(jié)果表明，該類基因可能參與了植物抗逆調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　 3.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將35S及逆境脅迫特異啟動子RD29A啟動的GarMSL、GarCYP和GarTHA1基因分別轉(zhuǎn)入煙草，初步結(jié)果表明過量表達(dá)GarMSL與GarCYP基因的煙草較脅迫