小麥——葉銹菌互作過(guò)程中鈣調(diào)素下游蛋白的篩選.pdf

1、細(xì)胞內(nèi)Ca2+H濃度的瞬時(shí)升高是觸發(fā)植物防御反應(yīng)的早期信號(hào)。鈣調(diào)素(Calmodulin,CaM))作為一類最重要的Ca2+結(jié)合蛋白可以通過(guò)與其下游CaM結(jié)合蛋白(Calmodulin binding protein,CaMBP)作用而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能,所以鑒定和分析病原體激發(fā)的CaMBP將有助于理解Ca2+-CaM信號(hào)調(diào)節(jié)的防御反應(yīng)機(jī)制。因此,對(duì)CaMBP的研究是揭示CaM作用機(jī)制的重要內(nèi)容,是探明Ca2+-CaM信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的關(guān)鍵

2、。
　　 本實(shí)驗(yàn)室以小麥-葉銹菌互作體系為研究對(duì)象,通過(guò)鈣信使阻斷或激活藥物試驗(yàn)、鈣離子的亞細(xì)胞定位、激發(fā)子刺激抗病性不同的小麥品種葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體后胞質(zhì)Ca2+變化的研究,證明Ca2+參與了小麥抵抗葉銹菌侵染的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程,并且通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting以及抑制性差減雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)在不親和互作早期,小麥CaM表達(dá)量升高,初步證明小麥CaM也參與了這一過(guò)程。
　　 為進(jìn)一步探討CaM在小麥抵抗葉銹

3、菌侵染的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的功能和作用機(jī)理并尋找與之相互作用的蛋白,本文以小麥鈣調(diào)素基因CAM2-3及CAM4-1構(gòu)建誘餌載體,用Matchmaker Library Construction&Screening Kits在小麥?zhǔn)苋~銹菌侵染后構(gòu)建的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)中尋找與CaM發(fā)生蛋白.蛋白相互作用的基因,得到了8個(gè)陽(yáng)性克隆。經(jīng)測(cè)序分析,其中408與水稻類乙烯誘導(dǎo)鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(ethylene-inducedcalmodulin-b

4、inding protein4-like)的C端同源性很高,暫時(shí)命名為TaCAMTA-like(calmodulin-binding transcription activators-like)。通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)驗(yàn)證了所篩選出的TaCAMTA-like蛋白在煙草細(xì)胞中也能與CaM發(fā)生相互作用,且它們之間的相互作用即可在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行也可在細(xì)

5、胞核中進(jìn)行；對(duì)TaCAMTA-like蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析,找到了TaCAMTA-Like可能與CaM相互作用的位點(diǎn),通過(guò)電泳遷移率變化分析試驗(yàn)進(jìn)一步證明了該位點(diǎn)與CaM的相互作用。在此基礎(chǔ)上,利用RT-PCR檢測(cè)了該基因在小麥接種葉銹菌后在轉(zhuǎn)錄水平的變化,結(jié)果表明在接種后的不親和組合中TaCAMTA-Like的表達(dá)量高于模擬接種,且在接種后4-48 h均保持較高水平的表達(dá),在接種后72 h其表達(dá)量下降并與對(duì)照相近；而親和組合中TaC