小麥與葉銹菌互作中Wrab17基因的克隆、表達(dá)及功能研究.pdf

1、小麥葉銹病是由葉銹菌(Puccinia triticina)所引起的病害，嚴(yán)重影響小麥(Triticumaestivum.L)的產(chǎn)量。為了更好地探究小麥抗葉銹菌機(jī)制，對小麥抗葉銹相關(guān)防衛(wèi)基因的研究就顯得極為重要。Wrab17基因?qū)儆诘谌M胚胎晚期豐富蛋白并且是響應(yīng)ABA的冷激活蛋白。本實(shí)驗(yàn)室已對小麥抗葉銹菌侵染機(jī)制進(jìn)行了多年的研究，前期工作中，我們構(gòu)建葉銹菌侵染早期的小麥SSH文庫及ESTs序列分析，在接種不親和組合早期，發(fā)現(xiàn)Wrab1

2、7基因呈現(xiàn)出顯著的上調(diào)表達(dá)，由此我們初步推測，不親和組合中Wrab17基因的上調(diào)表達(dá)可能在小麥與葉銹菌互作過程中發(fā)揮著重要作用。過敏性反應(yīng)(Hypersensitive reaction，HR)是不親和組合中小麥抵御葉銹菌侵染的一種常見方式。本試驗(yàn)通過以小麥品種‘洛夫林10’(L10)與葉銹菌生理小種260、165分別組成不親和組合和親和組合，以此展開試驗(yàn)，為明確Wrab17基因在小麥與葉銹菌互作所誘發(fā)HR中的作用奠定基礎(chǔ)。本研究主要獲

3、得以下結(jié)果:
　　1.利用RT-PCR技術(shù)，克隆獲得了小麥L10中Wrab17基因的CDS區(qū)。
　　2.構(gòu)建了Wrab17原核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21進(jìn)行原核表達(dá)。通過His親和純化，獲得了單一的Wrab17蛋白，得到其兔多抗血清，Western Blotting技術(shù)檢測多克隆抗體，獲得了特異性抗體。
　　3.通過RT-PCR技術(shù)，檢測了葉銹菌侵染小麥不同時(shí)間點(diǎn)Wrab17基因mRNA水平的表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)在

4、不親和互作早期Wrab17基因的表達(dá)量明顯高于親和組合。通過Western Blotting技術(shù)，檢測了葉銹菌侵染小麥不同時(shí)間點(diǎn)Wrab17蛋白水平表達(dá)量的變化。Wrab17蛋白的表達(dá)與RNA水平表達(dá)趨勢基本類似，由此推斷，Wrab17參與了小麥與葉銹菌互作。
　　4.構(gòu)建了Wrab17基因亞細(xì)胞定位載體，將含有Wrab17基因載體質(zhì)粒的注射緩沖液注射煙草，使Wrab17基因在煙草細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，Wrab1

5、7在胞質(zhì)及細(xì)胞核中表達(dá)。
　　5.構(gòu)建了Wrab17基因RNAi載體，通過實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化的小麥成熟胚轉(zhuǎn)化體系，對L10成熟胚進(jìn)行了Wrab17基因的RNAi遺傳轉(zhuǎn)化，通過Southern檢測獲得RNAi陽性植株。
　　6.利用RNAi沉默小麥品種L10 Wrab17基因后的T1代陽性植株，與對照相比，接種不親和葉銹菌小種260后72h葉銹菌誘導(dǎo)的HR面積減少;接種親和葉銹菌小種165后，葉銹菌的夏孢子堆增加，表明Wrab17