水稻與RBSDV互作過(guò)程中OsRNase3功能的初步研究.pdf

1、植物的S-LikeRNase是RibonucleasesT2家族的成員之一，不僅參與植物衰老和脫落等過(guò)程磷酸鹽的重復(fù)利用，而且在防衛(wèi)反應(yīng)中起著重要作用，能抵抗病毒、真菌等病原物的侵染。水稻黑條矮縮病毒（Riceblack-streakeddwarfvirus，RBSDV）隸屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟(jì)病毒屬（Fijivirus）第2組，主要侵染水稻、玉米、小麥等禾本科作物，為糧食生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　本實(shí)驗(yàn)

2、室前期通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)在RBSDV侵染后特異性表達(dá)。有研究報(bào)道OsRNase3能與RBSDVP5b互作。目前OsRNase3的功能還不明確，其在水稻與RBSDV互作過(guò)程中的作用有待研究。為此，本論文從以下三個(gè)方面進(jìn)一步研究了OsRNase3在水稻與RBSDV互作過(guò)程中的作用。
　　1.RBSDV侵染對(duì)寄主植物OsRNase3表達(dá)量的影響。
　　為了明確RBSDV侵染對(duì)寄主植物OsRNase3表達(dá)的影響，本文采用Re

3、al-timePCR方法定量分析RBSDV侵染后水稻核糖核酸酶表達(dá)量的變化，同時(shí)分析了RBSDV侵染對(duì)另外兩個(gè)寄主植物小麥和玉米中核糖核酸酶基因表達(dá)量的變化。此外，比較了水稻感病品種和抗病品種上接種RBSDV后OsRNase3表達(dá)量的差異。
　　Real-timePCR分析結(jié)果表明，在水稻感病品種日本晴上接種RBSDV后，葉片和莖稈中OsRNase3mRNA表達(dá)量是對(duì)照的3.08倍、6.9倍;在感病品種淮稻5號(hào)上接種RBSDV后，

4、葉片和莖稈中OsRNase3mRNA的表達(dá)量是對(duì)照的3.75倍和4.89倍。親緣關(guān)系分析表明玉米和小麥中與OsRNase3親緣關(guān)系最近的核糖核酸酶為ZmaRNS1和TaeRNS4。Real-timePCR分析結(jié)果表明，在玉米和小麥上接種RBSDV后，ZmaRNS1和TaeRNS4的mRNA表達(dá)量分別為對(duì)照的3.49和1.89倍。RBSDV侵染后，三種寄主植物的核糖核酸酶表達(dá)量均上調(diào)，表明核糖核酸酶可能在抗病毒過(guò)程中有重要作用。
　

5、　為分析OsRNase3的表達(dá)量是否與RBSDV的積累量相關(guān)，我們分析了水稻不同部位病毒積累量和OsRNase3表達(dá)量之間的關(guān)系。結(jié)果表明，水稻品種日本晴和淮稻5號(hào)感染RBSDV后，RBSDVP10在莖稈中的積累量分別是葉片的13.1倍和5倍，而OsRNase3在莖稈中表達(dá)量分別是葉片的2.3倍和4.7倍。以上結(jié)果說(shuō)明，水稻莖稈中病毒的積累量高于葉片，OsRNase3的表達(dá)量與病毒的積累量存在相關(guān)性，病毒積累量高的部位OsRNase3的

6、表達(dá)量也高，進(jìn)一步表明OsRNase3在抗病毒過(guò)程中起重要作用。
　　為分析OsRNase3是否與水稻抗RBSDV的特性相關(guān)，我們分析了感病品種日本晴和具有部分抗性的水稻品種津稻263在RBSDV侵染后OsRNase3表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，日本晴接種RBSDV后，葉鞘、葉和莖中OsRNase3表達(dá)量分別是對(duì)照的4.1、5.6、8.1倍，津稻263品種接種RBSDV后，葉鞘、葉和莖中OsRNase3表達(dá)量是對(duì)照的5.2、6.1、9

7、.6倍?？共∑贩N接種RBSDV后OsRNase3的表達(dá)量高于感病品種，推測(cè)OsRNase3與水稻的抗病毒功能相關(guān)。
　　2.構(gòu)建OsRNase3的過(guò)量表達(dá)植株和RNAi干擾植株研究OsRNase3的功能。
　　為了進(jìn)一步分析水稻OsRNase3的功能，本研究構(gòu)建了pCAMBIA1301-OsRNase3和pCAMBIA1300-OsRNase3載體，用于轉(zhuǎn)化水稻;構(gòu)建了pCAMBIA1301-OsRNase3載體，用于轉(zhuǎn)化煙

8、草。PCR克隆500bp的OsRNase3基因片段，通過(guò)正向和反向連入中間載體中間載體pBluescript-intron，并最終連接至pCAMBIA1300，獲得含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的的RNAi沉默表達(dá)載體1300-OsRNase3-in-OsRNase3，用于轉(zhuǎn)化水稻，進(jìn)一步研究其功能。
　　為了確定OsRNase3在植物亞細(xì)胞中的定位，構(gòu)建了GFP融合蛋白表達(dá)載體1301-GFP-OsRNase3，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后浸潤(rùn)本氏煙，觀察OsR

9、Nase3的亞細(xì)胞定位。
　　3.OsRNase3與病毒蛋白之間的互作關(guān)系
　　RBSDVS5的ORF2編碼蛋白存在2種起始位點(diǎn)，兩種不同起始位點(diǎn)的編碼蛋白相差28個(gè)氨基酸。為研究位點(diǎn)差異與水稻互作的關(guān)系，我們分析了水稻中核糖核酸酶OsRNase3與兩種不同起始位點(diǎn)的編碼蛋白P5-2、P5-2Δ之間的互作。酵母雙雜交結(jié)果顯示，OsRNase3均能與P5-2、P5-2Δ發(fā)生互作，表明S5的ORF2編碼蛋白的始位點(diǎn)與病毒的互作沒(méi)