圍產(chǎn)期奶牛外周血液學(xué)及免疫相關(guān)細(xì)胞因子和TLR-4基因表達(dá)規(guī)律的研究.pdf

1、圍產(chǎn)期是奶牛管理上的一個(gè)重要階段，其管理水平直接影響到產(chǎn)后的繁殖和泌乳性能。奶牛圍產(chǎn)期外周血白細(xì)胞功能發(fā)生一定程度的紊亂，其主要表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞免疫功能減弱。目前對該階段的研究主要集中在能量負(fù)平衡以及飼料添加劑等方面，而對于該階段奶牛機(jī)體血液學(xué)指標(biāo)及機(jī)體免疫力相關(guān)基因表達(dá)研究國內(nèi)還存在空白，尤其是圍產(chǎn)期階段淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞相關(guān)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的研究還未見報(bào)道。在分析和綜述了先前研究的基礎(chǔ)上，本研究以產(chǎn)前21天、14天、7天、產(chǎn)

2、犢當(dāng)天0天、產(chǎn)后7天、14天和21天7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的外周血淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞為研究對象，通過RT-PCR、FCM和WB等手段對調(diào)節(jié)外周血中性粒細(xì)胞(PMN) TLR-4通路(TLR-4，CD14，MD-2)基因、淋巴細(xì)胞中CD3+、CD4+、CD8+及IL-2和IL-4細(xì)胞因子的表達(dá)來進(jìn)行了研究，以期通過闡明圍產(chǎn)期外周血中淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及機(jī)體免疫力相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律，為以后改善該階段奶牛的免疫狀況提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。
　　

3、 主要研究結(jié)果如下:
　　 1奶牛圍產(chǎn)期血液學(xué)的研究
　　 通過對外周血中各種細(xì)胞數(shù)量以及血漿中GPT，GOT和GSH-Px酶的活性分析表明:白細(xì)胞總數(shù)在產(chǎn)前7天，14天顯著低于其它組(P＜0.05）;淋巴細(xì)胞從產(chǎn)前21天（3.34±0.13×109）/L逐漸降低至產(chǎn)后7天（2.41±0.13×109）/L，隨后又逐漸升高;相對于吞噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在產(chǎn)犢期達(dá)到（1.45±0.02×109）/L和（3.12±0.26×

4、109）/L峰值，而嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞在產(chǎn)犢時(shí)卻僅為（0.13±0.06×109）/L和（0.05±0.03×109）/L，為7組中的最低值。
　　 從測定的結(jié)果可以看出，產(chǎn)前外周血紅細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，產(chǎn)犢日達(dá)到峰值(6.04±1.02×1012)/L后逐漸降低，產(chǎn)前與產(chǎn)后差異顯著(p＜0.05)。血紅蛋白的含量在產(chǎn)前21天逐漸升高，產(chǎn)犢時(shí)達(dá)到最高水平，產(chǎn)后較低。血小板在產(chǎn)前21天逐漸增加，產(chǎn)犢后迅速降到最低值，之后逐漸

5、升高。
　　 血漿中酶活性分析表明，除GPT在圍產(chǎn)期差異不顯著（P＞0.05）外，GOT和GSH-Px兩種酶的活性在一定時(shí)期內(nèi)存在顯著差異，特別是反映氧化應(yīng)激的GSH-Px其產(chǎn)后第7天時(shí)達(dá)到峰值，極顯著高于其它組(P＜0.01)。
　　 2圍產(chǎn)期外周血T淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子表達(dá)的研究
　　 通過應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測定CD3+、CD4+、CD8+及實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)檢測細(xì)胞因子IL-2，IL-4 mRNA表

6、達(dá)分析表明:血液中CD3+的比例在產(chǎn)前21天內(nèi)占（50.8±4.61％），產(chǎn)后14天內(nèi)降低到（33.3±3.53％），兩者差異極顯著（P＜0.01）;CD4+在產(chǎn)前21天內(nèi)保持較高水平（21.38±0.65％），產(chǎn)后21天內(nèi)維持在較低水平（6.89±0.32％），與產(chǎn)前差異極顯著(P＜0.01); CD8+的比例在產(chǎn)犢時(shí)達(dá)到最高水平（16.91±2.02％），差異顯著（P＜0.05）;而與機(jī)體免疫力直接相關(guān)的CD4+/CD8+的比值呈現(xiàn)

7、產(chǎn)前高而產(chǎn)后低的趨勢，產(chǎn)前CD4+/CD8+＞1，產(chǎn)后CD4+/CD8+＜1。IL-2 mRNA的表達(dá)量在產(chǎn)后0～14天內(nèi)下調(diào)，之后上升。IL-4mRNA的表達(dá)量產(chǎn)犢期達(dá)到最高隨后下降，至第7天降至最低。
　　 3圍產(chǎn)期血液PMN中TLR-4途徑mRNA表達(dá)量的研究
　　 TLR-4途徑(TLR-4、CD14、MD-2)是調(diào)節(jié)PMN識別病原菌的主要通路。該通路上基因表達(dá)的趨勢直接反映機(jī)體的免疫狀態(tài)。本研究應(yīng)用RT-PCR

8、分析了圍產(chǎn)期外周血PMN細(xì)胞中TLR-4途徑(TLR-4、CD14、MD-2)的mRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):PMN中TLR-4途徑基因(TLR-4，CD14，MD-2)中，TLR-4和CD14在產(chǎn)后14天內(nèi)mRNA的表達(dá)量下調(diào)，而MD-2僅在產(chǎn)后7天下調(diào)。
　　 4圍產(chǎn)期TLR-4蛋白的表達(dá)量分析
　　 為進(jìn)一步研究圍產(chǎn)期間TLR-4的變化，我們主要應(yīng)用變性聚丙烯酰胺和Western Blot技術(shù)分別檢測了PMN中總蛋白和影

9、響PMN關(guān)鍵基因的TLR-4蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，研究發(fā)現(xiàn):(1)血液PMN中總蛋白含量在不同階段差異不顯著（P＞0.05），可能與維持細(xì)胞活性的主要蛋白表達(dá)恒定有關(guān)，所表達(dá)的蛋白分子量在55～70 KDa之間占據(jù)表達(dá)優(yōu)勢。(2)產(chǎn)后14天內(nèi)TLR-4蛋白表達(dá)顯著降低。
　　 通過以上研究我們可以得出以下結(jié)論:
　　 1奶牛圍產(chǎn)期階段外周血中白細(xì)胞數(shù)量（淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、吞噬細(xì)胞等）及GOT、GSH-Px酶活性存在一定程

10、度的變化;
　　 2淋巴細(xì)胞的T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+的數(shù)量和比例發(fā)生變化，尤其是產(chǎn)后CD4+/CD8+的比例較低，CD4+/CD8+＜1。
　　 3外周血中淋巴細(xì)胞中IL-2、IL-4的mRNA表達(dá)量發(fā)生改變。其中IL-2在產(chǎn)后14天內(nèi)下調(diào)差異極顯著，IL-4在產(chǎn)后7天下調(diào)差異極顯著。
　　 4調(diào)節(jié)PMN紊亂的TLR-4途徑基因(TLR-4，CD14，MD-2) mRNA表達(dá)量在產(chǎn)后一定時(shí)間內(nèi)下調(diào)