FimH蛋白對(duì)尿路細(xì)胞TLR4及其相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)和抗感染作用的影響.pdf

1、目的:尿路感染(urinary tract infection,UTI)是常見(jiàn)的感染性疾病,80％以上由尿路致病性大腸桿菌(UPEC)引起。FimH蛋白是UPECⅠ型菌毛的頂端蛋白,是細(xì)菌感染尿路細(xì)胞的關(guān)鍵因素,它能特異地與膀胱表皮細(xì)胞表面的甘露糖糖蛋白結(jié)合,誘導(dǎo)宿主細(xì)胞局部重排而直接介導(dǎo)UPEC的侵入,引起膀胱炎和反復(fù)發(fā)作的尿路感染(UTIs),目前己成為預(yù)防細(xì)菌性尿路感染的候選靶蛋白。用FimH蛋白免疫動(dòng)物,可誘導(dǎo)高水平特異性Fim

2、H抗體(IgG和SIgA)的產(chǎn)生,并能與90％以上的表達(dá)有FimH的大腸桿菌發(fā)生交叉反應(yīng),對(duì)尿路感染具有一定的保護(hù)作用。我們以前的研究也得到了相似的結(jié)果。
　　 研究發(fā)現(xiàn),FimH蛋白是TLR4的一種新的病原相關(guān)分子模式,能夠直接與巨噬細(xì)胞表面的TLR4結(jié)合,通過(guò)MyD88依賴的信號(hào)通路的激活,促進(jìn)TNF-α等細(xì)胞因子的產(chǎn)生,提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的抗病毒活性。此外,FimH還可通過(guò)TLR4依賴的途徑激活NK細(xì)胞,產(chǎn)生IFN-γ提

3、高NK細(xì)胞抗病毒活性?？梢?jiàn)FimH蛋白對(duì)固有性免疫也具有調(diào)節(jié)作用。TLR4也表達(dá)于尿路上皮細(xì)胞,參與尿路細(xì)胞的抗感染作用,且FimH蛋白對(duì)尿路細(xì)胞和TLR4的作用還未見(jiàn)研究報(bào)道。
　　 本課題旨在研究FimH蛋白對(duì)膀胱上皮細(xì)胞,腎小管內(nèi)皮細(xì)胞TLR4表達(dá)和相關(guān)炎癥因子的調(diào)節(jié)作用,研究FimH蛋白對(duì)尿路細(xì)胞的抗菌作用的影響,以及對(duì)小鼠膀胱感染模型中炎癥反應(yīng)強(qiáng)度的影響,為進(jìn)一步研究FimH蛋白對(duì)尿路粘膜固有性免疫的調(diào)節(jié)作用提供實(shí)驗(yàn)依

4、據(jù)。
　　 方法:
　　 1目的蛋白的純化:將本室已構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-fimH轉(zhuǎn)染感受態(tài)E.coli BL-21,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白FimH,經(jīng)SDS-PAGE鑒定后,純化、定量;MTT法檢測(cè)融合蛋白的細(xì)胞毒性;鱟變形細(xì)胞溶解物L(fēng)PS試劑盒測(cè)定LPS含量。
　　 2將制備的FimH蛋白取不同濃度分別刺激膀胱上皮癌5637細(xì)胞株、腎小管癌上皮A498細(xì)胞株和巨噬細(xì)胞Thp-1,流式細(xì)胞儀檢測(cè)

5、細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)變化,應(yīng)用Real-Time PCR檢測(cè)細(xì)胞因子IL-6、IL-8、TNF-αmRNA的表達(dá)變化。
　　 3不同濃度的FimH蛋白刺激5637細(xì)胞48小時(shí),加入大腸桿菌U30共培養(yǎng)2h,洗去細(xì)胞外的U30菌,用0.2％的Triton-X100溶解細(xì)胞,溶解液稀釋后用LB平板培養(yǎng)過(guò)夜,菌落計(jì)數(shù),評(píng)價(jià)FimH蛋白對(duì)膀胱細(xì)胞抗菌作用的影響。
　　 4.將制備的FimH蛋白腹腔注射BALB/c小鼠,設(shè)空白對(duì)

6、照組(注射生理鹽水),100ug/只,每組15只,連續(xù)注射7天后取小鼠膀胱和腎組織,Real-time PCR檢測(cè)IL-6,TNF-α等細(xì)胞因子,免疫組化觀察組織TLR4表達(dá)。
　　 5用U30菌經(jīng)尿道上行感染小鼠,制備成膀胱感染模型,將FimH蛋白腹腔注射感染小鼠,共三天,以生理鹽水為對(duì)照,每組15只,Real-timePCR檢Nd,鼠膀胱和腎組織IL-6,TNF-a等細(xì)胞因子mRNA的表達(dá),膀胱HE染色觀察FimH蛋白作用后

7、膀胱組織炎癥侵潤(rùn)程度。
　　 結(jié)果:
　　 1成功純化目的蛋白FimH,蛋白定量濃度為166.5ug/ml,檢測(cè)蛋白LPS含量為1030pg/ml,即FimH蛋白中內(nèi)毒素含量為6.18pg/ug,參考文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)FimH蛋白溶液內(nèi)為L(zhǎng)PS4～7pg/ug時(shí),LPS無(wú)活性作用。經(jīng)MTT法檢測(cè)證明當(dāng)?shù)鞍譌imH濃度≤25ug/ml時(shí)對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。
　　 2流式細(xì)胞儀檢測(cè)FimH作用于5637、A498和THP-1三種細(xì)

8、胞48h后,細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)水平均較空白對(duì)照組顯著增高(P＜0.05)。
　　 3 FimH作用于膀胱癌上皮細(xì)胞株5637、腎小管癌上皮細(xì)胞株A498和巨噬細(xì)胞THP-124h后Real-time PCR檢測(cè)顯示:5637和A498的IL-6,IL-8 mRNA表達(dá)水平一致性增高,TNF-α,MyD88則無(wú)明顯變化;THP-1細(xì)胞IL-6、TNF-α、MyD88 mRNA表達(dá)與空白對(duì)照組和LPS對(duì)照組比較均顯著升高(P＜0

9、.05)。
　　 4 U30細(xì)菌刺激低、中、高濃度FimH蛋白分別作用的5637細(xì)胞顯示:與對(duì)照組細(xì)菌數(shù)(230±69)相比,FimH0.5μg/ml、2.Sμg/ml和12.5μg/ml濃度蛋白作用組內(nèi)U30細(xì)菌數(shù)顯著降低(P＜0.05),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;其中中濃度(2.5μg/ml)FimH蛋白作用組5637細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)(77±20)呈下降趨勢(shì)最明顯。
　　 5 FimH蛋白作用小鼠膀胱和腎IL-6,TNF-α mRN

10、A表達(dá)水平顯著增高(P＜0.01),且膀胱組織TNF-α mRNA表達(dá)明顯高于腎組織;免疫組化顯示FimH蛋白作用組小鼠膀胱、腎組織TLR4表達(dá)量均高于生理鹽水對(duì)照組。
　　 6感染模型小鼠應(yīng)用FimH蛋白后,膀胱和腎IL-6,TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。膀胱組織HE染色顯示與生理鹽水對(duì)照組比較FimH作用組膀胱組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少,粘膜表面平滑、完整。
　　 結(jié)論:
　　 1尿路致

11、病性大腸桿菌的FimH蛋白,能顯著提高5637細(xì)胞、A498細(xì)胞和THP-1細(xì)胞表面TLR4的表達(dá),在體內(nèi)也能促進(jìn)膀胱、腎臟細(xì)胞TLR4的表達(dá)。
　　 2 FimH蛋白能促進(jìn)5637細(xì)胞和A498細(xì)胞IL-6,IL-8 mRNA表達(dá)增高,且可能是以MyD88非依賴途徑。而FimH蛋白作用與THP-1細(xì)胞,顯著促進(jìn)IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)且以MyD88依賴途徑。
　　 3 FimH蛋白能顯著增強(qiáng)5637細(xì)胞對(duì)U