仿刺參(Apostichopus japonicus)微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用.pdf

1、仿刺參(Apostichopus japonicus)又名刺參,主要分布于我國北方、日本、朝鮮半島及俄羅斯的遠(yuǎn)東地區(qū),由于具有較高的食用和養(yǎng)生保健價值,迅速成為我國海水養(yǎng)殖的重要品種。培養(yǎng)抗逆性高、生長速度快的新品種是保持刺參養(yǎng)殖業(yè)健康與可持續(xù)性發(fā)展的有效途徑,而飛速發(fā)展的分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)為優(yōu)良品種的快速培育提供了理論基礎(chǔ)和實踐經(jīng)驗。本研究以仿刺參為主要研究材料,探討了仿刺參微衛(wèi)星標(biāo)記的有效篩選方法及微衛(wèi)星標(biāo)記在仿刺參標(biāo)記輔助育種中

2、的應(yīng)用。
　　 1.仿刺參微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選和評價
　　 本研究利用EST文庫篩查法和富集文庫.菌落原位雜交法篩選得到了仿刺參的多個微衛(wèi)星序列。利用至少48個仿刺參個體對全部位點進行了評價,結(jié)果共獲得了276個多態(tài)性良好的微衛(wèi)星標(biāo)記。其中通過EST文庫篩查法獲得了59個多態(tài)性微衛(wèi)星位點,不同的位點獲得的等位基因數(shù)為2～10個不等,平均每個位點擴增得到4.8個等位基因,觀測雜合度和期望雜合度的范圍分別為0.000～0.900

3、和0.202～0.890;通過富集文庫—菌落原位雜交法獲得了217個多態(tài)性位點,全部位點獲得的等位基因數(shù)目范圍為2～15個,平均每個位點擴增得到6.8個等位基因,觀測雜合度和期望雜合度的范圍分別為0.000～1.000和0.180～0.948。這些微衛(wèi)星標(biāo)記將成為仿刺參群體遺傳學(xué)研究、微衛(wèi)星遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、經(jīng)濟性狀的QTL定位和分子標(biāo)記輔助選育等工作的有力工具。
　　 2.全基因組擴增技術(shù)在仿刺參微衛(wèi)星標(biāo)記分型中的應(yīng)用

4、　　 在基因型的檢測過程中,仿刺參幼蟲由于個體大小的限制而無法為大量位點的PCR擴增提供足量的模板。為了解決這一問題,本實驗采用MDA全基因組擴增技術(shù)對仿刺參耳狀幼蟲進行了全基因組擴增,并評價了此方法的擴增效率和保真性,為通過MDA方法從仿刺參幼蟲中獲得大量DNA以滿足分子標(biāo)記分析的需要做好了技術(shù)準(zhǔn)備。選用了仿刺參一個F1代全同胞家系的2個親本和30個處于大耳期的幼蟲為實驗材料,使用QIAGEN Repli-g UltraFast M

5、ini Kit全基因組擴增試劑盒對子代幼蟲進行全基因組擴增。瓊脂糖凝膠電泳與紫外分光光度計檢測顯示,得到的基因組DNA片段較為完整,每次反應(yīng)可以獲得的DNA總量在1000ng左右。以這些DNA為模板,隨機擴增了50對微衛(wèi)星引物,獲得了1500個基因型。與親本基因型進行比對的結(jié)果顯示,在1500個基因型中有7個基因型出現(xiàn)了錯誤,占全部基因型數(shù)目的0.47％。在錯誤的基因型中,有4個為等位基因增加、2個為等位基因丟失、1個為等位基因片段長度

6、錯誤。本研究的結(jié)果表明,通過MDA技術(shù)對仿刺參幼蟲進行擴增,可以得到優(yōu)質(zhì)、足量的DNA,這些DNA能夠進一步的應(yīng)用于微衛(wèi)星標(biāo)記的分析中。
　　 3.微衛(wèi)星標(biāo)記在仿刺參家系鑒定中的應(yīng)用
　　 本研究使用多個微衛(wèi)星標(biāo)記,在仿刺參(9♀)×(1♂)、(10♀)×(10♂)兩個關(guān)聯(lián)家系中,對標(biāo)記的親子鑒定能力和親子鑒定的準(zhǔn)確率進行了研究。首先選擇12個微衛(wèi)星位點,對這兩個家系的30個親本在每個位點上的基因型進行了分析,將所獲得的

7、分型結(jié)果使用軟件Cervus3.0進行了計算機模擬分析。模擬分析的結(jié)果顯示,在子代兩個親本基因型都未知的情況下,全部12個位點的累計排除率(Exc11)為99.824％;在已知一個親本基因型的情況下,全部12個位點的累計排除率(Exc12)為99.996％。在單位點排除率最高的7個位點組合時,Exc11和Exc12分別為99.016％和99.912％。在單獨養(yǎng)殖的(9♀)×(1♂)家系中對這7個位點組合的準(zhǔn)確率進行檢驗,鑒定結(jié)果與養(yǎng)殖記

8、錄比對顯示,270個子代在父本已知、有9個候選母本的情況下,有264個子代個體找到了正確的母本,鑒定率為97.78％。在將這些微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用于(10♀)×(10♂)混養(yǎng)家系時,在40個可能的親本、500個子代個體中,93.8％的子代可以鑒定其父母本。本研究建立了一套適用于仿刺參的微衛(wèi)星標(biāo)記親子鑒定體系,對選育中保持家系信息、確定親緣關(guān)系、追蹤家系提供了有力工具,為仿刺參的育種規(guī)劃奠定了良好基礎(chǔ)。
　　 4.仿刺參微衛(wèi)星連鎖圖譜的

9、構(gòu)建及生長相關(guān)性狀QTLs定位的初步研究
　　 為了加強仿刺參選育工作的有效性和準(zhǔn)確性,真正在仿刺參中實現(xiàn)分子標(biāo)記輔助選育,本文利用1個(9♀)×(1♂)的關(guān)聯(lián)家系的F1子代和509個微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建了仿刺參的雄性遺傳連鎖圖譜。全部位點中共有298個可以用于父本作圖,最終共193個標(biāo)記被定位到框架圖譜上,形成22個連鎖群,圖譜總長度為1905cM,標(biāo)記的平均間隔為10.0cM。每個連鎖群的長度在36.9cM和182.4cM之間,平