ISSR分子生物技術(shù)對中藥蒲公英的應(yīng)用研究.pdf

1、　　目的： 利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)和ITS序列分析技術(shù)對不同品種、不同產(chǎn)地蒲公英間的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進行分析,為蒲公英品種鑒定、種質(zhì)資源的合理利用與開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法： 采用CTAB法提取蒲公英葉片的DNA,利用正交試驗設(shè)計,從Taq酶MIX、模板DNA、引物3種因素2個水平,對蒲公英ISSR?PCR反應(yīng)體系進行考察,采用單因素實驗對其擴增程序進行優(yōu)化,最終確立蒲公英 ISSR?PCR 最佳反應(yīng)體系及擴增程序。

2、從50條ISSR引物中篩選適合的擴增引物,通過梯度篩選確定其最佳退火溫；對來自3個省的21居群蒲公英進行PCR擴增,并利用軟件POPGEN 32分析Nei′s基因多樣性指數(shù)(He)和Shannon信息指數(shù)(I),用NTsys2.10e軟件進行聚類分析和主坐標(biāo)分析。用特異引物對 20 居群蒲公英進行 PCR 擴增,擴增產(chǎn)物利用膠回收試劑盒回收純化后,直接測序法測序,用DNASRTAR軟件分析測序結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　

3、1 通過蒲公英ISSR?PCR反應(yīng)體系及擴增程序的建立與優(yōu)化條件的實驗,確立了適合于蒲公英的最佳 ISSR?PCR 反應(yīng)方法,即在 25μl 反應(yīng)體系中,內(nèi)含 Taq 酶MIX15μL(1.25U TaqDNA聚合酶,1.8 mmol/LMg2+ , dNTPs各0.24mmol/L),0.3μmol/L引物,5ng模板。擴增程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s,引物在篩選后的最佳退火溫度退火45s,72℃延伸2min,共計4

4、0個循環(huán),循環(huán)結(jié)束后在72℃延伸7min。
　　2 通過蒲公英ISSR-PCR引物的篩選實驗,在實驗1的基礎(chǔ)上,從50 條ISSR引物中篩選出了16 條擴增穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的ISSR 引物,并通過梯度PCR 試驗,確定了引物最佳退火溫度。
　　3 通過蒲公英遺傳多樣性ISSR分析,由16條ISSR引物共擴增出166條條帶,其中多態(tài)性條帶 150 條,多態(tài)性帶的百分率為 90.4%。平均 Ner′s 基因多樣性指數(shù)為0

5、.2865,平均Shannon指數(shù)為0.4370。遺傳距離和遺傳一致度分別為0.1562~0.5902和0.5542~0.8554。
　　4 通過UPMGA法進行聚類分析與主坐標(biāo)分析顯示,聚類結(jié)果與地理來源有較強的一致性,可以看出來源于同一地區(qū)的蒲公英種質(zhì)聚在一起,呈現(xiàn)出一定的地域性分布規(guī)律。
　　5 通過對不同種群蒲公英的ITS序列分析：
　　得出各樣品的ITS序列總長為711bp,ITS1、5.8S、I

6、TS2序列長度分別為225bp、262bp、226bp。DNASRTAR軟件分析顯示蒲公英ITS序列變異與其地理分布也有一定的相關(guān)性。
　　結(jié)論： 采用單因子試驗和正交設(shè)計方法可以快速建立ISSR-PCR 反應(yīng)體系,經(jīng)過驗證,證明該體系穩(wěn)定可靠,可用于蒲公英遺傳分析。采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析蒲公英遺傳多樣性,蒲公英表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性,表明ISSR標(biāo)記技術(shù)對蒲公英進行分子水平的遺傳多樣性分析。ITS序列分析技術(shù)可用于蒲公英不