實例分析分子生物學技術的應用

1、實例分析分子生物學技術的應用,-------以interleukin 24為例,二、基因功能研究 1.mRNA水平和蛋白質水平表達譜 2.體外生物學活性：細胞模型，調節(jié)表達水平 細胞活力、細胞增殖、細胞周期、抑瘤活性、等等 3.體內生物學活性：抑瘤活性、成血管活性、等等,內容,一、基因的基本信息：發(fā)現、序列、染色體定位、 表達調控、同源性分子、修飾、降解、細胞內定位、

2、 空間結構 等等,三、作用機制：信號轉導途徑和相互作用分子四、應用,235 documents,IF5.977.57.22.765.03.069.384.35.521.34.15.256.48,Oncogene 1995, 11: 2477-2486Cancer Biol Ther 2003;2:S23–S37,mda-5，mda-6 (p21)，mda-7/IL-24，mda-9/s

3、yntenin,,Subtraction hybridization,一、mda-7/IL-24,Paul B. FisherColumbia Uni.,1.發(fā)現,雜交產物的克隆、篩選和測序,除去雜交體、過量探針、鹽和小片段,Cancer Biol Ther 2003;2:S23–S37,2.提交序列,NCBI/Genbank,,,3.染色體定位,Data base analysis,Cyto Growth Factor Rev

4、. 2003, 14: 35–51,IL-10 Family,Mol Med. 2001;7(4):271-282,4.與IL-24同源的分子,一致的 (*)保守的 (:)相似的 (.),Cytokine Growth Factor Rev. 2003;14:35–51Immunology. 2005;114(2):166-70,NCBI Blast, KEGG,5.基因的表達調控,J Cell Physiol. 2000;18

5、5(1):36-46,基因組文庫,IL-24cDNA探針,PCR,測序,啟動子：GCG 啟動子搜索轉錄起始位點：引物延伸和作圖,轉錄水平,啟動子序列,J Cell Physiol. 2000;185(1):36-46,AP-1: PKC-activated TFC/EBP: growth arrest and terminal differentiation associa

6、ted TF,,轉錄起始前復合物：真核生物RNA聚合酶不與DNA分子直接結合，而需依靠眾多的轉錄因子。,轉錄前起始復合物,拼板理論：一個真核生物基因的轉錄需要3至5個轉錄因子。轉錄因子之間互相結合，生成有活性和專一性的復合物，再與RNA聚合酶搭配而有針對性地結合、轉錄相應的基因。,RNA聚合酶保護法,Luciferase assay system,J Cell Physiol. 2000;185(1):36-46,NdeI-NheI是

7、啟動子轉錄活性的重要區(qū)域，C/EBP-b和cJUN/AP-1提高轉錄活性。,重要區(qū)域,nuclear lysates,arrow 1：C/EBP-barrow 2：AP-1,J Cell Physiol. 2000;185(1):36-46,EMSA,C/EBP-b和cJUN/AP-1結合在mda-7/IL-24啟動子上。,cell lysates,,,IFN-β和MEZ單獨或聯合處理不能顯著改變啟動子活性,Luciferase as

8、say system,Oncogene. 2000;19(10):1362-8,3’-UTR的ARE調節(jié)該基因在終末分化過程中的mRNA水平,ARE： AU-rich elements,Luciferase assay system,Oncogene. 2000;19(10):1362-8,7.分泌蛋白,Mol Ther. 2004;9(3):355-67,Overexpression, WB,,Ad.IL-24 cell lysat

9、e,Ad.IL-24 supernatant,分泌作用的抑制劑,Mol Ther. 2004;9(3):355-67,WB,Cytokine Growth Factor Rev 2003;14:35–51,PNGase F: endoglycanase F endo-O: 內-O糖苷酶,6. 翻譯后修飾,Overexpression, WB,J Biol Chem. 2002;277(9):7341-7,MDA-7/IL-24蛋白可被

10、糖基化修飾,Mol Ther. 2004;9(3):355-67,glycopeptidase F,L SN,7.細胞內定位,Mol Ther. 2004;9(3):355-67,IFC,Mol Ther. 2004;9(3):355-67,,Quantitative receptor binding analysis,J Biol Chem. 2002;277(9):7341-7,,,,IL-20R2, IL-20R1/IL-

11、20R2, IL-22R1/IL-20R2結合AP的活性高。,8.受體,J Biol Chem. 2002;277(9):7341-7,Cell surface staining assay,RT-PCR,Exp Dermat. 2006; 15: 991–1004,Cancer Biol Ther. 2003;2:S23–S37,RT-PCR,PC NC,Cytokine. 2008; 41: 16–23,FACS,IFC,IL-

12、22R1/IL-20R2IL-20R1/IL-20R2,Immunology. 2005;114(2):166-70,Cyto Growth Factor Rev. 2003, 14: 35–51,3.前列腺 4.睪丸 5.卵巢 6.小腸 7.結腸,1. mRNA表達譜：分布在人的免疫系統(tǒng),NB,二、基因功能的研究,Oncogene 2001;20:7051–7063.,Cyto Gro Fac Rev. 2003;14:

13、35–51,?：untreated +：IFN-β+ MEZ , 24 h,NB,Oncogene. 2001; 20: 7051 – 7063,Real-time RT-PCR,在黑色素瘤惡性發(fā)展過程中，mda-7/IL-24的mRNA表達水平逐漸降低，直至完全喪失。,Pharmacol Ther. 2006;111(3):596-628,Kaplan-Meier survival analysis,Cancer Cell Inte

14、r. 2010; 10:29,2.蛋白水平：,IHC,Cytokine. 2008; 41: 16–23,類風濕關節(jié)滑膜,NC,sublining mononuclear cells,endothelial cells of blood vessels,Cytokine. 2008; 41: 16–23,ELISA,免疫系統(tǒng)：脾、胸腺、外周血白細胞特定細胞：黑色素細胞、痣、早期黑色素瘤細胞、 平滑肌

15、細胞、 皮膚成纖維細胞、 皮膚傷口邊緣和基底類成纖維細胞樣細胞 腫瘤細胞：50多種，無內源性MDA-7/IL-24蛋白表達。,分布：局限性,基因在靶細胞中的過表達,Adenovirus,J Cell Physiol. 2007;210(2):549-59,CAR檢測(Coxsackie-adenovirus receptors),FACS, WB,,,人正常卵巢上皮細胞,卵巢癌細胞,靶細胞中重組蛋白

16、的檢測,WB,卵巢癌細胞,Mol Cancer. 2007;6(1):11,Cancer Immunol Immunother. 2007; 56:205–215,,7d,3.細胞活力,Crystal violet staining,Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22,TRAIL：腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體,Mol Med. 2001;7(4):271-282,Trypan blue excl

17、usion assay,Cancer Immunol Immunother. 2007; 56:205–215,Trypan blue exclusion assay,,Ad.mda7能夠降低腫瘤細胞的活力。,特異性抑制多種腫瘤細胞生長,4.體外抑瘤活性：細胞增殖,Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22,MTT,3H-thymidine Assay,Mol Med. 2001;7(4):271-282

18、,,,Cancer Res. 2006; 66(16): 8182-8191,Colony formation,缺失信號肽的突變體(SP-mda-7)具有抗瘤活性,Cancer Res. 2004; 64:2988–2993.,WB, MTT,Matrigel Invasion Assay, Colony formation,C8161,C8161,Cancer Res. 2004; 64:2988–2993.,Xenograft

19、tumors in nude mice,5.體內抑瘤活性,,SW620,Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22,Cancer Biol Ther 2003;2:S23–S37,,SW620,Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22,Xenograft tumors in nude mice,IHC,No Ab1,IL-24,Cancer Gene Ther. 2006

20、; 13: 1011–1022,Subcutaneous SW620 tumors,抗瘤活性源自MDA-7/IL-24蛋白的表達,Mol Cancer. 2007;6(1):11,MDAH2774 tumor-bearing animal,Pharmacol Ther. 2006;111(3):596-628,特異性抑制多種腫瘤細胞生長,MDA-MB453,Cancer Immunol Immunother. 2007; 56:205–

21、215,HUVEC,Oncogene. 2002 ;21(29):4558-66,5.細胞周期分析,FACS,使腫瘤細胞G2/M期阻滯,Cancer Immunol Immunother. 2007; 56:205–215,WB,6.細胞凋亡,Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22,FACS analysis,PI staining,,Annexin V staining,Mol Med. 2001;

22、 7(4): 271–282,,FO-1 cellsSB203580：p38MARK的抑制劑,DNA Ladder,PNAS. 2002;99:10054–10059.,TUNEL,PBS,IL-24,Cancer Gene Ther. 2006; 13: 1011–1022,Subcutaneous SW620 tumors,H1299 tumor-bearing animal,Oncogene. 2002; 21: 4558 –

23、4566,IHC, TUNEL,PCR, RT-PCR,IHC, TUNEL,TUNEL,MCF7,Mol Med. 2001;7(4):271-282,Cancer Immunol Immunother. 2007; 56:205–215,Caspase3 analysis,MDA-MB453,人正常卵巢上皮細胞,卵巢癌細胞,caspase-3、caspase-8和 PARP被切割,Mol Cancer. 2007;6(1):11,腺

24、病毒感染結直腸癌細胞48h后,Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22,,,,肺癌細胞,J Cell Physiol. 2007;210(2):549-59,具有劑量依賴效應,Z-VAD.fmk: Caspase的廣譜抑制劑,Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22,,,保護細胞免受凋亡,與Bcl-2家族基因相關,Cancer Gene Ther. 2006;13(11

25、):1011-22,刺激特定細胞凋亡,參與caspase9活化和自切割,腺病毒感染結直腸癌細胞48h,HUVEC+Ad.mda7,HUVEC+Ad.mda7+Matrigel,Oncogene. 2002 ;21(29):4558-66,Tube formation,7.抗血管形成作用：,抑制內皮細胞形成管狀結構,Oncogene. 2002 ;21(29):4558-66,血管內皮細胞標志物表達降低,H1299 tumor-bear

26、ing animals,1. p38MAPK途徑,三、作用機制,Mol Cancer. 2007;6(1):11,WB,PKR: double-stranded RNA-activated protein kinase,,PNAS. 2002;99(15):10054-9,SB：p38MARK抑制劑p38DN：p38負顯性突變體,黑色素瘤細胞FO-1,,,,,PNAS. 2002;99(15):10054-9,NB， WB,GADD：

27、生長阻滯和DNA損傷誘導的基因,,,,,NB， WB,3d,PNAS. 2002;99(15):10054-9,Antisense, MTT,PNAS. 2002;99(15):10054-9,Ad.vec (white bars) Ad.mda-7 (black bars),p38 MAPK途徑和GADD家族成員的關系,PNAS. 2002;99(15):10054-9,2. PI3K信號途徑,Mol Ther. 2003;8(2)

28、:207-19,H1299/Ad.mda-7+2400 cDNA,Microarray,Mol Ther. 2003;8(2):207-19,WB,H1299,Trypan blue exclusion assay,Mol Ther. 2003;8(2):207-19,,,Biotechniques. 2002; Suppl: 30 – 39.,3.選擇性誘導腫瘤細胞凋亡具有多種機制,Cancer Res. 2004;64:2988–2

29、993.,Cancer Res. 2003;63(23):8138–8144.,MDA-7蛋白誘導前列腺癌細胞凋亡的可能機制,Cancer Res. 2005; 65(22): 10128-10138,四、臨床應用研究,Cancer Res. 2005; 65(22): 10128-10138,Cycle1 Day30,Ⅰ期臨床試驗證明mda-7/IL-24使用安全、有臨床療效。,INGN241(重組腺病毒): Introge

30、n公司, Ⅰ期：28例; Ⅱ期：進行中,INGN 241 (Ad.mda-7) treatment of a melanoma metastasis in a right supraclavicular lymph node.,Mol Ther. 2005；11, 149–159,2.Ad.mda-7/IL-24與化療藥物聯合使用,抗體：4D5, trastuzumab , Herceptin,Her-2: human epiderm

31、al growth factor receptor-2,Her-2+轉移乳腺癌,30% Her-2 +有效,Cancer Gene Ther. 2006;13(10):958-68,Cancer Gene Ther. 2006;13(10):958-68,FACS,Cancer Gene Ther. 2006;13(10):958-68,Trypan blue exclusion staining,L=Ad-luc,Cancer Gen

32、e Ther. 2006;13(10):958-68,Ad.mda-7/IL24 + Herceptin,,Cancer Gene Ther. 2006;13(10):958-68,Herceptin (1 and 2 mg/ml),Trypan blue exclusion staining,MCF7,MDA-MB-453,MDA-MB-453,Cancer Gene Ther. 2006;13(10):958-68,與Hercept

33、in聯合使用，抗瘤效果更好，并擴大抗瘤譜。,Cancer Gene Ther. 2006;13(10):958-68,MCF-7-Her-18: Her-2-overexpressing,EGFR: epidermal growth factor-receptor,(EGFR-Wild type),Ad.mda-7＋ Gef,J Cell Physiol. 2007;210(2):549-59,,,MTT,Ge?tinib: an o

34、rally active selective reversible inhibitor of the EGFR tyrosine kinase.,J Cell Physiol. 2007;210(2):549-59,與gefitinib聯合使用，抗瘤效果提高。,J Cell Physiol. 2007;210(2):549-59,sMDA-7/IL-24,(1) 抑制血管內皮細胞成管能力,Cancer Res. 2003;63(16)

35、:5105-13,3.基因工程重組MDA-7/IL-24蛋白藥物,Cancer Res. 2003;63(16):5105-13,Cancer Res. 2003;63(16):5105-13,Cancer Biol Ther 2003;2:S23–S37,裸鼠,Cancer Res. 2003;63(16):5105-13Mol Ther. 2005;11(5):724-33,MDA-MB4543,Cancer Immunol Im

36、munother. 2007;56(2):205-15,具有體內抑瘤活性,Cancer Res. 2003;63(16):5105-13,sMDA-7/IL-24的抗瘤活性與其受體相關,Cancer Immunol Immunother. 2007;56(2):205-15,sMDA-7/IL-24能夠抑制多種腫瘤細胞增殖，并誘導凋亡,Cancer Immunol Immunother. 2007;56(2):205-15,小結：,思考

37、題：,在日常生活中，你遇到哪些感興趣而又不知道答案的生命科學相關問題？請用假說演繹法對其中的一個問題進行分析和探討 。你如何理解研究思路和實驗技術之間的關系？你認為在公共實驗室做實驗應該注意哪些問題？請從正、反兩方面說明。在進行PCR實驗之前，你應該做哪些準備工作？請設計將mda-7基因CDS插入到真核表達載體pSecTag2A中的上下游引物。,Fig1,7. Fig2是PCR結果，每個泳道的模板不同，你如何改進PCR條件

38、 使得A-E樣品能得到特異性好的目的條帶？,6.你如何評價PCR電泳結果(Fig1)？為什么？如有問題如何解決？,Fig1,8. 你用熱激法將連接產物轉化到細菌中，LB-Amp平板沒有克隆，請分析 可能的原因。9. Western-blot實驗中的影響因素有哪些？如果你得到的是沒有任何條帶 的白板，你準備怎么辦？10.一位同學未能將PCR產物連入表達載體，請分析可能是哪些環(huán)節(jié)出問題？,11.實驗室現有的試劑如下：

39、1M Tris-HCl，1M KCl，Triton X-100，30.5% MgCl2(MW203)；已知1×反應 buffer中各試劑的濃度分別是：10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1% Triton X-100, 1.5mM MgCl2。現在要配5ml的 10×反應 buffer，如何用現有試劑配制？請列出計算過程。,12. 對于一個分子生物學的關鍵詞/術語，你有哪