分子生物學(xué)基本技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用

1、分子生物學(xué)基本技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用分子生物學(xué)基本技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用DNA重組技術(shù)（或基因工程）是20世紀(jì)生物學(xué)的偉大成就，并已滲透到生命科學(xué)包括醫(yī)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，為腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究和臨床診斷及治療提供了嶄新的技術(shù)和有用的工具。本附錄扼要介紹在分子腫瘤學(xué)領(lǐng)域中常用的分子生物學(xué)基本技術(shù)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用，著重介紹它們的原理和應(yīng)用。至于具體的技術(shù)方法和操作步驟可參閱《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（第二版，科學(xué)出版社，1992年）等實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。一、常用

2、的分子生物學(xué)基本技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測(cè)方法的靈敏性，它已成為分子生物學(xué)中最常用的基本技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于基因克隆的篩選，酶切圖譜的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測(cè)等。其基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫室度及離子強(qiáng)度等）可按堿基互補(bǔ)原成雙鏈。雜交的雙方是待測(cè)核酸序列及探針（probe）待測(cè)核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細(xì)胞總RNA。核

3、酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNA或RNA片段。根據(jù)其來(lái)源和性質(zhì)可分為cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。固相雜交固相雜交（solidphasehybridization）是將變性的DNA固定于固體基質(zhì)（硝酸纖維素膜或尼龍濾膜）上，再與探針進(jìn)行雜交，故也稱為膜上印跡雜交。斑步雜交（dothybridization）是道先將被測(cè)的DNA或RNA變性后固定在濾膜

4、上然后加入過(guò)量的標(biāo)記好的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。該法的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，事先不用限制性內(nèi)切酶消化或凝膠電永分離核酸樣品，可在同一張膜上同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè)；根據(jù)斑點(diǎn)雜并的結(jié)果，可以推算出雜交陽(yáng)性的拷貝數(shù)。該法的缺點(diǎn)是不能鑒定所測(cè)基因的相對(duì)分子質(zhì)量，而且特異性較差，有一定比例的假陽(yáng)性。印跡雜交（blottinghybridization）Southern印跡雜交：凝膠電離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將凝膠上的DNA變性并在原位將單

5、鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤固定，再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的已標(biāo)記的探針進(jìn)行那時(shí)交反應(yīng)，用放射性自顯影或酶反應(yīng)顯色，檢測(cè)特定大小分子的含量?？蛇M(jìn)行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RELP）等。Nthern印跡雜交:由Southerm印雜交法演變而來(lái)，其被測(cè)樣品是RNA。經(jīng)甲醛或聚乙二醛變性及電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，進(jìn)行雜交反應(yīng)，以鑒定基中特定mRNA分子的

6、量與大小。該法是研究基因表達(dá)常用的方法，可推臬出癌基因的表達(dá)程度。該法的優(yōu)點(diǎn)是特異性高，可精確定位；能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響；不需要從組織中提取核酸，對(duì)于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性；并可完整地保持組織與細(xì)胞的形態(tài)。因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)的研究，如基因定位、基因制失，基因易位、特異基因整合部物色檢測(cè)等研究。近年來(lái)由定性發(fā)展到定量，方法更為完善。DNA分子克隆技術(shù)（也稱基因克隆技術(shù)）

7、在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接，轉(zhuǎn)入細(xì)胞獲得大量拷貝的過(guò)程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步驟包括：制備目的基因→將目的基因與載體用限制性內(nèi)切酶切割和連接，制成DNA重組→導(dǎo)入宿主細(xì)胞→篩選、鑒定→擴(kuò)增和表達(dá)。載體（vecs）在細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制，并帶動(dòng)重組的分子片段共同增殖，從而產(chǎn)生大量的DNA分子片段。主要目的是獲得某一基因或NDA片段的大量拷貝，有了這些與親本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的結(jié)構(gòu)與功能，隨

8、著引入的DNA片段不同，有兩種DNA庫(kù)，一種是基因組文庫(kù)（genomiclibrary）另一種是cDNA庫(kù)。載體所謂載體是指攜帶靶DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具。細(xì)菌質(zhì)粒是一種細(xì)菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA，分子大小為120kb，對(duì)細(xì)菌的某些代謝活動(dòng)和抗藥性表型具有一定的作用。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上人工改造拼接而成。最常用的質(zhì)粒是pBR322。噬菌體（phaeg）噬菌體是感染細(xì)菌的病毒，按其生活周期分為溶菌型及溶

9、原型兩型。用野生型λ噬菌體改造和構(gòu)建的噬菌體載體是線性雙鏈DNA，基因組約為50kb，最常用的嘵菌體為λDNA及其衍生系列。黏性質(zhì)粒（cos）是由質(zhì)粒與噬菌體λDNA組成的一種46kb的環(huán)狀雜種DNA。表達(dá)型載體將上述細(xì)菌質(zhì)粒載體或噬菌體載體接上啟動(dòng)基因及多聚核糖體的基因序列組成了表達(dá)型載體。基因庫(kù)的建造含有某種生物體全部基歷的隨機(jī)片段的重組DNA克隆群體，其含有感光趣的基因片段的重組子，可以通過(guò)標(biāo)記探針與基因庫(kù)中的重組子雜交等方法而篩