綿羊肺腺瘤病相關(guān)基因突變的檢測(cè)及綿羊、山羊內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的擴(kuò)增.pdf

1、研究背景：綿羊肺腺瘤病(ovine pulmonary adenomatosis,OPA)是一種由綿羊肺腺瘤病病毒（jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV）引起的肺臟腫瘤性疾病。病原JSRV為β反轉(zhuǎn)錄病毒。自然感染綿羊潛伏期為2～24個(gè)月,人工感染綿羊潛伏期為3～7個(gè)月，患病綿羊病死率為100％。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將該病列為B類傳染病。JSRV的Env蛋白是在體內(nèi)和體外起主要作用的癌蛋白，有研究表明 PI3K/A

2、KT和RAS-MEK-MAPK是JSRV Env蛋白轉(zhuǎn)化細(xì)胞的信號(hào)通路。建立特異、快速診斷方法是本病防控的基礎(chǔ)。病毒致病機(jī)制的研究是深入了解本病的重點(diǎn)。
　　研究目的方法：建立特異性診斷OPA的方法和研究OPA與癌癥相關(guān)基因突變的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)在JSRV結(jié)構(gòu)基因研究的基礎(chǔ)上參照GenBank中登錄的JSRV基因序列，針對(duì)編碼Env蛋白YXXM基序列設(shè)計(jì)了特異性PCR引物，建立了PCR檢測(cè)方法，并對(duì)保存的病料進(jìn)行了檢測(cè)。參照SANGE

3、R、UCSC、GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)nras、kras、pik3ca、egfr、p53基因發(fā)生突變較高的位點(diǎn)的外顯子進(jìn)行擴(kuò)增。應(yīng)用SSCP-PCR技術(shù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，對(duì)疑似突變的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。參照GenBank中登錄的enJSRV基因序列，設(shè)計(jì)三對(duì)特異性引物擴(kuò)增出一株綿羊內(nèi)源性肺腺瘤反轉(zhuǎn)錄病毒和一株山羊內(nèi)源性肺腺瘤反轉(zhuǎn)錄病毒基因片段。以山羊基因組DNA為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增山羊內(nèi)源性病毒基因片段，分別連接 PMD-18T

4、載體并測(cè)序。利用Methyl Primer Express v1.0查找綿羊和山羊enJSRV啟動(dòng)子區(qū)CpG島，各設(shè)計(jì)一對(duì)甲基化引物和一對(duì)非甲基化引物。以處理的綿羊和山羊基因組DNA為模板，檢測(cè)綿羊胎兒不同組織基因組DNA的甲基化情況，和不同山羊組織基因組DNA甲基化情況。構(gòu)建含enJSRV的pro、env融合基因的真核表達(dá)載體EGFP-enpro、pcDNA3.1-enenv并在小鼠肺上皮細(xì)胞系TC-1中表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：（

5、1）建立的特異性 PCR檢測(cè)方法，具有高的特異性、重復(fù)性，可檢測(cè)出最低10～20拷貝的JSRV前病毒DNA。檢測(cè)出JSRV陽(yáng)性樣品10例。（2）應(yīng)用PCR-SSCP檢測(cè)法,對(duì)10例JSRV陽(yáng)性樣品和10例陰性樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在2例陽(yáng)性標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)kras基因第二外顯子第12氨基酸雜合型突變，CDS突變35G〉T，氨基酸突變G12V。1例陽(yáng)性樣品檢測(cè)出p53基因第7外顯子雜合型突變，CDS突變825T>C,氨基酸未發(fā)生突變C275C。（3

6、）完成了一株綿羊內(nèi)源性肺腺瘤病毒和一株山羊內(nèi)源性肺腺瘤病毒基因序列的測(cè)定和序列分析，結(jié)果顯示測(cè)得的綿羊 enJSRVN序列與 enJSRV-20（EF680302.1）病毒株的核苷酸同源性為99.4%，與外源性綿羊肺腺瘤病毒JS7(AF357971.1)病毒株的核苷酸同源性為90.9%。測(cè)得的山羊GERV序列與內(nèi)源性綿羊肺腺瘤病毒株enJSRV-5（EF680305.1）的核苷酸同源性為94.2%，與外源性綿羊肺腺瘤病毒株 JS-7（A

7、F357971.1）的核苷酸同源性為88.1.%。擴(kuò)增的綿羊和山羊內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的同源性為93.1%。對(duì)enJSRV基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)，結(jié)果顯示綿羊和山羊不同組織中均存在甲基化與非甲基化修飾的病毒啟動(dòng)子。（4）經(jīng)過(guò)酶切鑒定pro、env基因成功連接入真核表達(dá)載體pEGFP-C1和pcDNA3.1（+），蛋白免疫熒光和Western Blot方法檢測(cè)顯示重組質(zhì)粒、EGFP-enpro、pcDNA3.1-enenv能夠在真核細(xì)胞中瞬時(shí)表

8、達(dá)。
　　結(jié)論：(1)本研究建立了JSRV的特異性檢測(cè)方法，對(duì)OPA的早期診斷和防控具有實(shí)用價(jià)值。(2)檢測(cè)到JSRV感染綿羊腫瘤組織基因組中kras、p53基因突變，對(duì)研究OPA的致病機(jī)制具有重要參考價(jià)值。(3)成功擴(kuò)增出一株綿羊和一株山羊enJSRV基因序列，檢測(cè)了綿羊和山羊enJSRV啟動(dòng)子區(qū)的甲基化修飾情況。（4）分別構(gòu)建了包含enJSRV的pro、env基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，為研究enJSRV的功能和抑制JSRV感染的作用