煙草抗怪鈴薯Y病毒(PVY)育種、抗性基因的克隆與功能分析.pdf

1、馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)是我國煙葉生產(chǎn)中的主要病害之一，近年來，隨著農(nóng)村保護(hù)地蔬菜栽培和馬鈴薯種植面積的擴(kuò)大，煙草PVY病毒病的發(fā)生與危害呈現(xiàn)急劇上升趨勢，在黑龍江、吉林、遼寧、山東、安徽和云南相繼出現(xiàn)大面積爆發(fā)流行，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。針對我國煙區(qū)缺乏抗PVY品種的生產(chǎn)實(shí)際，本研究通過篩選煙草PVY抗源，并對主要抗源材料進(jìn)行抗性遺傳分析，克隆其抗性基因，同時開展抗PVY煙草育種工作，主要包括以下內(nèi)容：

2、　　 1.采用人工接種方式，在溫室和田間病圃中分別對17份和114份煙草種質(zhì)進(jìn)行PVY抗病性鑒定，篩選出高抗馬鈴薯Y病毒的煙草種質(zhì)資源C151、CV91，達(dá)到中抗水平的有CV87，87414和NC55，表現(xiàn)多基因水平抗性。
　　 2.對C151、CV91、CV87和NC55等抗源材料進(jìn)行了抗性遺傳分析，證實(shí)C151為少數(shù)基因控制，不完全顯性，CV91為少數(shù)隱性基因控制，易受顯性感病基因影響，與沒有顯性感病基因品種雜交表現(xiàn)抗性。

3、CV87分別與IslandGold和龍江851雜交組合的F2代抗感比例不同且表現(xiàn)連續(xù)分布，證實(shí)為多數(shù)微效基因控制，且為加性基因控制。NC55×9625組合F2代中無病株-病輕株-病重株≈8-5-3，基本表現(xiàn)連續(xù)分布，NC55是多數(shù)微效抗性基因。
　　 3.利用高抗PVY的CV91做親本，選育出了烤煙常規(guī)純系品種龍江911和雜種優(yōu)勢利用品種LJ237，其中龍江911為中抗馬鈴薯Y病毒病，LJ237高抗馬鈴薯Y病毒病，利用CV87育

4、成了抗馬鈴薯Y病毒的烤煙品種LJ981。
　　 4.提出微效水平抗性基因富集思路，利用中等水平抗性資源，選配適當(dāng)?shù)碾s交組合，在雜交后代材料中富集、濃縮抗性基因，得到高于抗性親本抗性的品種，重視水平抗性資源的開發(fā)與利用。
　　 5.以高抗PVY的C151為試驗(yàn)材料，利用抑制差減雜交技術(shù)(SuppressionSubtractiveHybridization，SSH)構(gòu)建了抗PVY相關(guān)基因的煙草葉片SSH文庫，對煙草葉片接種

5、PVY前后的差異表達(dá)基因片段進(jìn)行測序，得到280多條EST序列。利用NCBI上的GenBank等公共數(shù)據(jù)庫對所獲得的280多條EST序列進(jìn)行生物信息分析和功能預(yù)測，其中與光合作用有關(guān)的RuBP羧化酶相關(guān)蛋白基因片段96條，林煙草和絨毛煙草葉綠體DNA片段12條，與抗病性有關(guān)的有：脂質(zhì)轉(zhuǎn)化酶基因片段15條，突變的過氧化氫酶基因片段8條，蛋白酶抑制劑基因片段32條，鐵氧還蛋白和鐵硫蛋白基因片段26條，糖基轉(zhuǎn)移酶3條，富含甘氨酸蛋白質(zhì)前體蛋白

6、9條。其他序列86條，未知基因片段71條。
　　 6、利用熒光定量PCR對5個可能與抗病性有關(guān)誘導(dǎo)表達(dá)片段的從開始接種到接種后72小時之間的0小時，12小時，24小時，36小時和72小時5個時間點(diǎn)基因的差異表達(dá)，并證實(shí)了所獲得的基因序列為真實(shí)誘導(dǎo)的表達(dá)序列。對此序列進(jìn)行RACE，最終獲得一個與PVY抗病性有關(guān)的全長cDNA序列。
　　 7、采用同源序列法，根據(jù)抗PVY的辣椒品種中的eIF4E基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，在抗PV