基于過(guò)表達(dá)策略驗(yàn)證煙草PVY抗性候選基因eIF4E的功能.pdf

1、馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)是馬鈴薯Y病毒組的主要成員之一。馬鈴薯Y病毒侵染寄主的機(jī)制是與位于植物體內(nèi)的一個(gè)翻譯起始因子eIF4E有關(guān)，eIF4E與病毒RNA5'端的類似于帽子結(jié)構(gòu)的連接蛋白VPg互作，加快了病毒RNA的翻譯。在辣椒和番茄中均已得到證實(shí)，因此嘗試在煙草中找到與PVY抗性相關(guān)的eIF4E家族中的對(duì)應(yīng)成員。
　　本研究首先參照豌豆、辣椒、番茄、萵苣及普通煙草中eIF4E和/或eIF（iso）4E

2、 mRNA序列，在煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（紅花大金元）中比對(duì)，獲得11個(gè)煙草中的eIF4E序列。再通過(guò)同源性分析以及RT-PCR與測(cè)序，得到2個(gè)PVY抗性候選基因-eIF4E-6、eIF4E-10。分別設(shè)計(jì)eIF4E-6、eIF4E-10的特異性引物，從感病材料LJ925中克隆，得到大小相同的750 bp的eIF4E-6、eIF4E-10基因，構(gòu)建eIF4E-6基因和eIF4E-10基因的植物表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將eIF4E-6基因和eI

3、F4E-10基因轉(zhuǎn)入抗性煙草品種VAM中，經(jīng)過(guò)在預(yù)培養(yǎng)2-3 d、農(nóng)桿菌浸染6 min、共培養(yǎng)3 d、100 mg/L的卡那霉素進(jìn)行抗性篩選、煉苗和移栽等一系列步驟，得到了eIF4E-6的抗性苗300株和eIF4E-10的抗性苗280株，從得到的轉(zhuǎn)化苗中各選出120株進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，eIF4E-6轉(zhuǎn)入煙草后的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率為88.3％，eIF4E-10基因轉(zhuǎn)入煙草的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率為84.2%。eIF4E-6、eIF4E-10各選出60株轉(zhuǎn)化