轉(zhuǎn)Bt基因水稻華恢1號檢測技術(shù)研究.pdf

1、隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的轉(zhuǎn)基因植物在全球范圍內(nèi)大量種植及商業(yè)化應(yīng)用，有必要建立科學(xué)、準(zhǔn)確、可靠的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)體系和方法。本研究以轉(zhuǎn)Bt基因水稻“華恢1號”為研究對象，從整合水平和轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了系統(tǒng)檢測研究，并對其非預(yù)期效應(yīng)進(jìn)行初步研究。主要結(jié)果如下：
　　 優(yōu)化建立了轉(zhuǎn)Bt基因水稻成分DNA水平的定性檢測技術(shù)體系。根據(jù)水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因蔗糖磷酸合成酶基因.9PS和“華恢1號”遺傳轉(zhuǎn)化時的載體質(zhì)粒pGL2RC7和pF

2、HBT1中的CaMV35S、NOS、HPT、CrylAb/Ac等元件和基因的特異性結(jié)構(gòu)，設(shè)計系列引物，采用定性PCR方法，可以準(zhǔn)確檢出華恢1號的目標(biāo)序列；靈敏度檢測結(jié)果顯示：DNA的最低檢出濃度為0.05ng/μL，即檢測極限為100個拷貝水稻單倍體基因組DNA，說明這些引物具有較高的特異性、準(zhǔn)確性和靈敏度。
　　 轉(zhuǎn)錄水平上檢測了“華恢1號”外源標(biāo)記基因、目的基因的時空表達(dá)情況。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，盡管在DNA水平上已檢

3、測出抗生素標(biāo)記基因片段的整合，但在轉(zhuǎn)錄水平上沒有表達(dá)，目的基因穩(wěn)定表達(dá)。對目的基因時空表達(dá)qRT-PCR分析結(jié)果表明，抗蟲基因CrylAb/Ac在華恢1號整個生育期的各個部位均表達(dá)，但其在不同時期、不同部位的表達(dá)量不同，存在時空效應(yīng)。以苗期莖部的表達(dá)量為參照，抽穗期苞葉和灌漿期苞葉表達(dá)量提高10倍以上，灌漿期莖和拔節(jié)期莖表達(dá)量提高5倍以上的；抽穗期莖、灌漿期葉、抽穗期葉、拔節(jié)期上葉、分蘗期莖、拔節(jié)期中葉、灌漿期穗部表達(dá)量提高2倍以上；苗

4、期葉、分蘗期葉、拔節(jié)期下葉的表達(dá)量稍有提高；抽穗期穗部的表達(dá)量下降。
　　 在轉(zhuǎn)錄水平上對“華恢1號”灌漿期葉部和穗部營養(yǎng)成分和抗?fàn)I養(yǎng)成分代謝途徑上的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行了非預(yù)期效應(yīng)檢測。結(jié)果表明：Bt基因的導(dǎo)入造成一些酶基因在華恢1號灌漿期葉部和穗部轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量顯著下降，以明恢63灌漿期葉部的表達(dá)量為參照進(jìn)行比較，與明恢63相比，華恢1號灌漿期葉部蔗糖磷酸合成酶基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量下降了19％，穗部的表達(dá)量下降了24％；華恢1號

5、灌漿期葉部ADPG焦磷酸化酶基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量沒有改變，穗部的表達(dá)量下降了86％；華恢1號灌漿期葉部GDP-甘露糖-3’，5’-差向異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量下降了57％，穗部的表達(dá)量下降了21％；華恢1號灌漿期葉部吡哆醛激酶基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量下降了14％，穗部的表達(dá)量下降了38％；華恢1號灌漿期葉部吡哆醇生物合成蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量下降了82％，穗部的表達(dá)量下降了60％；華恢1號灌漿期葉部肌醇-1-磷酸合成酶基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)