芋病原病毒鑒定及其分子特性研究.pdf

1、芋[Colocasia esculenta(L.)Schott]是天南星科(Araceae)芋屬(Colocasia)多年生宿根草本植物，作為糧食和蔬菜在世界各地廣泛種植。病毒病害嚴(yán)重威脅芋的生產(chǎn)，本研究調(diào)查了中國芋病毒病的發(fā)生狀況，采用PCR和RT-PCR的方法對我國芋病原病毒進行了鑒定，并分析了相關(guān)病毒的分子特性，旨在明確我國芋病原病毒的種類及危害情況，并為相關(guān)病毒檢測技術(shù)及芋病毒病防控體系的建立提供技術(shù)支持。所獲研究結(jié)果如下。

2、r>　　 1.對湖北地區(qū)種植的芋進行了田間調(diào)查，田間芋病毒病發(fā)生普遍，癥狀表現(xiàn)主要有花葉、羽狀斑駁、畸形皺縮和褪綠斑點等。2010年9月底的調(diào)查結(jié)果顯示，武漢蔬菜科學(xué)研究所水生蔬菜資源圃保存的芋品種，表現(xiàn)以上四種癥狀的植株率分別為26.92%、16.67%、28.21%和3.85%。
　　 2.采用RT-PCR技術(shù)對采自中國湖北、浙江和山東3省的129份芋樣品的芋花葉病毒(Dasheen mosaic virus，DsMV)進

3、行了檢測，綜合檢出率為27.9%。其中武漢蔬菜所提供的17份芋組培苗樣品DsMV檢出率最高，達(dá)58.8%，但均無明顯病毒病癥狀；而來自湖北不同田間的99份樣品的DsMV檢出率為9.5%-42.9%，來自浙江金華田間的10份樣品DsMV檢出率為40.0%，來自山東臨沂田間的3份樣品未檢測到該病毒，這112份田間樣品均表現(xiàn)出明顯的病毒病癥狀。對其中14個DsMV分離物的317 bp擴增產(chǎn)物(為外殼蛋白基因的一部分)序列分析的結(jié)果顯示，各分離

4、物內(nèi)的核苷酸變異相對較低，而分離物間存在較大的分子變異，相似性為68.3%-97.8%。對來自湖北的2個分離物DsMV-SCS和DsMV-ZP及浙江金華的1個分離物DsMV-JH的外殼蛋白基因(coat protein gene，CP)進行了測序，全長分別為951 bp、942bp和987 bp，3個分離物間CP基因核苷酸相似性分別為78.2%、79.0%和85.5%，氨基酸相似性分別為85.0%、82.3%和89.2%，與已報道的Ds

5、MV的CP基因的核苷酸相似性分別為73.0%-78.9%、73.9%-91.9%和74.3%-92.1%，氨基酸相似性分別為77.0%-86.5%、74.8%-97.1%和74.8%-98.2%，系統(tǒng)進化分析顯示，各DsMV分離物的系統(tǒng)進化關(guān)系與其寄主和地理來源無明顯的相關(guān)性。
　　 3.采用已報道的桿狀DNA病毒屬通用引物BadnaFP/BadnaRP，對26份芋樣品進行PCR檢測，從13份樣品中擴增得到大小約600bp的目標(biāo)

6、產(chǎn)物。序列分析結(jié)果顯示，13份樣品中有7份樣品12個克隆含有桿狀DNA病毒屬病毒的保守序列，序列長度均為576bp，而另外6份樣品所得序列長度在600bp左右，大小不一，且并非桿狀DNA病毒屬病毒序列，說明此對引物并不適合作為該屬病毒的檢測引物。所得7個樣品12個克隆的桿狀DNA病毒屬病毒序列比對結(jié)果顯示，其分離物內(nèi)和分離物間核苷酸序列相似性分別為89.9%-100%和78.8%-99.5%，氨基酸序列相似性分別為94.8%-100%和

7、81.8%-99.5%。該序列與NCBI上所登錄的桿狀DNA病毒屬病毒表現(xiàn)出較高的同源性，但均低于80%，系統(tǒng)進化分析顯示其為桿狀DNA病毒屬的病毒新種。根據(jù)所得的桿狀DNA病毒屬7個分離物12個克隆的序列設(shè)計用于此病毒檢測的引物P197和P433，對51份芋樣品進行了檢測，從38個樣品中擴增得到大小為257bp的目標(biāo)產(chǎn)物，檢出率為74.5%。
　　 4.在進一步克隆此病毒基因組全長的過程中，用根據(jù)已得序列設(shè)計的正向引物P197

8、和反向引物RP1408，從8個陽性樣品中得到13個克隆的目標(biāo)序列，各序列長度不一，在1724bp-1771bp之間，該序列各分離物內(nèi)和分離物間核苷酸相似性分別為85.5%-98.9%和85.5%-99.6%；序列分析顯示該序列5’端約600bp的序列為桿狀DNA病毒屬病毒RT和Rnase H基因保守序列，而3’端約1.1kb的序列則不是桿狀DNA病毒屬病毒序列，根據(jù)3’端約1.1kb序列設(shè)計的正向引物P1161和反向引物RP1408能從