廣西雙生病毒的分子鑒定.pdf

1、雙生病毒是植物病毒中唯一一類具有孿生顆粒形態(tài)的單鏈環(huán)狀DNA病毒，已在多種重要經(jīng)濟(jì)作物上引起危害。我國已從廣東、廣西、云南和海南等地的煙草、番茄、南瓜和番木瓜等多種作物上相繼發(fā)現(xiàn)了多種雙生病毒，并對其基因組結(jié)構(gòu)及變異進(jìn)行了深入研究。雙生病毒寄主范圍廣，變異快。為了明確雙生病毒的發(fā)生、分布與傳播，從廣西番木瓜、番茄、煙草、一品紅、苦苣菜及勝紅薊上采集了32個(gè)具有雙生病毒典型癥狀的樣品并對病毒進(jìn)行了分子檢測與鑒定。 采集的32個(gè)樣品

2、用雙生病毒的簡并引物PA和PB進(jìn)行了PCR檢測，均可擴(kuò)增到約500bp的片段?？寺『笮蛄袦y定表明，32個(gè)樣本均受粉虱傳雙生病毒侵染，序列比較發(fā)現(xiàn)這些病毒分離物至少可分為4種病毒類型。從每種病毒類型中選取代表，共對9個(gè)分離物的基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)研究。 GX-1、GX-2和GX-3為番茄上的分離物，對這三個(gè)分離物的全基因組進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)其DNA-A全長均為2752個(gè)核苷酸(nts)，序列比較表明，它們相互之間的相似性為98.9～

3、99.7％，與中國勝紅薊黃脈病毒(AgeratumyellowveinChinavirus，AYVCNV)的相似性最高，為86.7％，因此GX-1、GX-2和GX-3是Begomovirus的一個(gè)新種，將它命名為廣西番茄曲葉病毒(TomatoleafcurlGuangxivirus，ToLCGXV)。對GX-1基因組進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ToLCGXV可能由AYVCNV和中國番茄曲葉病毒(TomatoleafcurlChinavirus，To

4、LCCNV)及另一未知病毒經(jīng)過重組產(chǎn)生。DNAβ分子的PCR檢測表明，除GX-3外，GX-1和GX-2都伴隨有衛(wèi)星DNA分子，Southern印跡檢測發(fā)現(xiàn)GX-3確實(shí)不伴隨DNAβ分子。 GX-4和G121～G128也為番茄上的分離物，對GX-4和G121的全基因組進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)分離物GX-4和G121的全序列分別為2738nts和2734nts。GX-4DNA-A與中國番木瓜曲葉病毒(PapayaleafcurlChinav

5、irus，PaLCuCNV)具最高相似性，為91.6％。根據(jù)雙生病毒分類原則，GX-4為PaLCuCNV的一個(gè)分離物。而G121DNA-A與中國番茄黃化曲葉病毒(TomatoyellowleafcurlChinavirus，TYLCCNV)的相似性最高，為96.2％。從番茄上分離的這9個(gè)樣本中其中5個(gè)樣本伴隨有DNAβ分子，序列比較發(fā)現(xiàn)，G121DNAβ屬于TYLCCNV類DNAβ分子，兩者相似性為90.6％，而GX-4、G122、G1

6、23和G126的DNAβ與TYLCCNV伴隨的DNAβ分子序列相似性僅為61.5～67.3％。 構(gòu)建了ToLCGXV-[GX-1]DNA-A的侵染性克隆。DNA-A單獨(dú)接種以及DNA-A和TYLCCNV-Y10β混合接種均可系統(tǒng)侵染本氏煙、心葉煙、普通煙、三生煙、珊西煙、番茄及矮牽牛，并誘導(dǎo)產(chǎn)生雙生病毒典型癥狀。 從煙草病株上分離到病毒分離物G102和G103，用雙生病毒特異性引物擴(kuò)增出的約500bp片段的序列相似性高達(dá)

7、99％。對G102基因組DNA-A全序列測定結(jié)果表明，其全長為2728nts，與TYLCCNV-[GX]同源性最高，達(dá)96.5％。因此G102是TYLCCNV的一個(gè)分離物，相應(yīng)地，G103也應(yīng)為TYLCCNV的一個(gè)分離物。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，G102和G103均伴隨有長為1342nts的衛(wèi)星DNA分子(DNAβ)，這兩個(gè)DNAβ分子的全序列與TYLCCNV的DNAβ同源性最高，分別為92.9％和93.4％。這是首次明確廣西分離的TYLCCN

8、V也伴隨有衛(wèi)星分子。 12個(gè)病毒分離物G88～G94和G105～G109分離自番木瓜病樣。從這些樣本中選取G94進(jìn)行基因組全序列測定，G94DNA-A全長為2739nts，序列比較表明，G94DNA-A全序列與ToLCCNV的相似性最高，為94.7％，因此，G94應(yīng)為ToLCCNV的一個(gè)分離物。用DNAβ的特異性引物beta01和beta02進(jìn)行DNAβ分子的PCR檢測，發(fā)現(xiàn)僅G91、G94和G108分離物伴隨有衛(wèi)星DNA分子，

9、全長分別為1340nts、1340nts和1342nts，序列比對后發(fā)現(xiàn)均與ToLCCNV的DNAβ的相似性最高，為96.9～99.2％。G88中還發(fā)現(xiàn)伴隨有缺陷型DNAβ分子。另外，從G109分離物中發(fā)現(xiàn)了存在PaLCuCNV和ToLCCNV的復(fù)合侵染。 對一品紅上的G35分離物的基因組全序列進(jìn)行了分析，G35DNA-A全長為2747nts，與ToLCGXV的相似性最高，為86.3％，因此G35為Begomovirus的一個(gè)新

10、種，將其命名為廣西一品紅曲葉病毒(EuphorbialeafcurlGuangxivirus，ELCGXV)。 病毒分離物G129和G130分離自苦苣菜，兩者用雙生病毒的簡并引物PA/PB進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的約500bp的片段的序列相似性為98.9％。對G129進(jìn)行了全序列測定，發(fā)現(xiàn)G129DNA-A全長2747nts，序列比較結(jié)果表明，它與AYVCNV相似性最高，達(dá)96.5％。因此G129為AYVCNV的一個(gè)分離物，同時(shí)說明苦