基于乙醇調(diào)控的Cre-lox重組系統(tǒng)在煙草中的功能驗(yàn)證.pdf

1、為實(shí)現(xiàn)目的基因在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的適時(shí)表達(dá),可通過在所要表達(dá)目的基因上游建立一個(gè)“基因開關(guān)”,構(gòu)建出可準(zhǔn)確調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的人工調(diào)控。Cre/lox重組系統(tǒng)由38.5 kD的Cre重組酶和34bp的fox特異性識(shí)別位點(diǎn)所構(gòu)成,該系統(tǒng)中的Cre重組酶能特異性識(shí)別并介導(dǎo)兩個(gè)lox識(shí)別位點(diǎn)之間的DNA序列發(fā)生刪除、倒位。Cre/lox系統(tǒng)重組功能在細(xì)菌、真菌、動(dòng)物以及植物等生物中表現(xiàn)高效穩(wěn)定,被廣泛應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因及基因功能鑒

2、定等領(lǐng)域的研究。另外,化學(xué)誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)的出現(xiàn)為人工調(diào)控基因的表達(dá)提供了可能。包括四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)、類固醇激活系統(tǒng)、銅制劑誘導(dǎo)系統(tǒng)、乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng)等均在植物中得到成功應(yīng)用。其中的乙醇誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)從構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)中發(fā)現(xiàn)的,該系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄因子alcR只有在與乙醇分子結(jié)合時(shí)才具有活性,可特異性作用于結(jié)構(gòu)基因alcA(酒精脫氫酶Ⅰ)的啟動(dòng)子,激活其下游目標(biāo)基因表達(dá)。研究顯示,該系統(tǒng)在誘導(dǎo)表達(dá)所需酒精濃度

3、范圍內(nèi)對(duì)植株生長(zhǎng)幾乎沒有任何生理毒害作用,具有誘導(dǎo)方式靈活、方便,本底極低,在實(shí)驗(yàn)室和大田都能有效使用的特點(diǎn)。本文根據(jù)上述兩套系統(tǒng)的特性,將Cre/lox重組系統(tǒng)和乙醇誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)相結(jié)合,將Cre重組酶基因的表達(dá)置于乙醇調(diào)控下,通過外源施加乙醇實(shí)現(xiàn)目的基因的人工表達(dá)調(diào)控,建立一條植物基因調(diào)控表達(dá)的新途徑。
　　 本文以煙草為研究對(duì)象,分別構(gòu)建兩個(gè)植物表達(dá)載體:一是乙醇調(diào)控的Cre重組酶表達(dá)載體,該載體中,轉(zhuǎn)錄因子alcR在35S

4、啟動(dòng)子的控制下組成性表達(dá),Cre重組酶基因在alcA啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。另外,構(gòu)建了一個(gè)GUS/Bar報(bào)告基因刪除激活表達(dá)載體,用于分析乙醇調(diào)控Cre重組酶的表達(dá)特點(diǎn)。該載體中35S啟動(dòng)子下游是位于兩個(gè)同向lox位點(diǎn)之間的報(bào)告基因GUS,GUS報(bào)告基因下游是缺少啟動(dòng)子的Bar除草劑抗性基因。將上述兩個(gè)載體用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入煙草獲得轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株中的Cre重組酶一旦啟動(dòng)表達(dá),將導(dǎo)致使其中的Gus基因刪除,下游的BAR基因啟

5、動(dòng)表達(dá)而獲得除草劑Basta的抗性。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤共轉(zhuǎn)化法,通過潮霉素和卡拉霉素雙抗篩選,將PCA13a1cRCre和PCA23GusBar轉(zhuǎn)入煙草獲得大量轉(zhuǎn)基因植株。
　　 2.隨機(jī)取37株在雙抗培養(yǎng)基(Kan和Hyg)正常生根的植株葉片進(jìn)行除草劑Basta的抗性鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在除草劑(PPT)濃度為10mg/L的分化培養(yǎng)基上,在37株植株中,編號(hào)為1、5、6、10、11、12、2

6、5、26、32、35和36號(hào)植株真葉葉盤在含除草劑(PPT)濃度為10mg/L的分化培養(yǎng)基上不能分化愈傷組織及芽且葉盤逐漸變白,說明對(duì)應(yīng)植株不具有除草劑Basta抗性,該類植株所占比例約為1/3。而其余共轉(zhuǎn)化植株真葉葉盤在含除草劑(PPT)濃度為10mg/L分化培養(yǎng)基上能分化愈傷組織及芽,具有抗除草劑Basta的能力,該類植株所占比例約為2/3。Gus基因表達(dá)分析結(jié)果顯示,在除草劑Basta抗性分析中所有非抗性植株葉片(1、5、6、10

7、、11、12、25、26、32、35和36號(hào)植株)均被染成藍(lán)色,具有抗性的植株葉片除了3、4和23號(hào)植株外,均未染上藍(lán)色。而進(jìn)一步的PCR.檢測(cè)結(jié)果表明不抗除草劑Basta且植株葉片染上藍(lán)色的植株均擴(kuò)增出預(yù)期大小為1.8kb的Gus基因目標(biāo)條帶,而抗除草劑以及葉片未染上藍(lán)色的植株均未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。
　　 3.對(duì)10、11、12以及32號(hào)Gus基因未被自動(dòng)刪除植株進(jìn)行外源乙醇誘導(dǎo)分析發(fā)現(xiàn),在乙醇誘導(dǎo)前,葉片能被染成藍(lán)色,表明Gu

8、s基因仍存在于植株中。用60ml4.0%濃度乙醇灌根處理48h后,對(duì)應(yīng)植株葉片在含除草劑(PPT)濃度為10mg/L培養(yǎng)基上保持綠色,對(duì)除草劑具有抗性。進(jìn)一步對(duì)誘導(dǎo)后植株的葉片進(jìn)行鐋的表達(dá)分析,結(jié)果顯示,四株植株葉片均未被染成藍(lán)色,顯示Gus基因已經(jīng)被刪除。
　　 4.自動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株alcR與Cre基因在未添加乙醇誘導(dǎo)情況下的RT-PCR結(jié)果顯示,自動(dòng)誘導(dǎo)啟動(dòng)轉(zhuǎn)基因植株的alcR轉(zhuǎn)錄因子均正常表達(dá)的同時(shí)伴隨Cre基因的表

9、達(dá)。顯示該乙醇誘導(dǎo)Cre重組系統(tǒng)在某些轉(zhuǎn)基因植株中確實(shí)存在背景表達(dá)現(xiàn)象。
　　 5.自動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá)和人工誘導(dǎo)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的半定量PCR以及定量PCR結(jié)果顯示,外源乙醇處理后,自動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的Cre表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加,表現(xiàn)出先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì),處理后24h時(shí)達(dá)到最高峰;人工誘導(dǎo)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的Cre表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加,表現(xiàn)出降低一增長(zhǎng)一降低的趨勢(shì),48h時(shí)達(dá)到最高峰,而24h表達(dá)量卻最低。但Cre基因在自動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá)