新型可誘導(dǎo)Cre重組酶的構(gòu)建.pdf

1、目的：DNA重組酶Cre及其作用位點(diǎn)loxP組成的細(xì)胞標(biāo)記系統(tǒng)在研究胰腺發(fā)育及成體胰島Beta形成過(guò)程中具有重要作用。本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)Cre重組酶嚴(yán)重放大胰島素啟動(dòng)子RIP非特異活性，對(duì)此我們采用點(diǎn)突變的方式對(duì)Cre進(jìn)行改造，降低其酶活性，使胰島素啟動(dòng)子RIP控制的Cre-loxP系統(tǒng)標(biāo)記胰島Beta細(xì)胞的特異性提高約15倍；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的可誘導(dǎo)型Cre，即定位于胞漿的與雌激素受體融合的CreER具有強(qiáng)烈的泄露現(xiàn)象，這使得利用此系

2、統(tǒng)作為研究工具的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)存在明顯漏洞。因此我們對(duì)Cre進(jìn)行徹底改造，構(gòu)建新型膜定位可誘導(dǎo)Cre標(biāo)記系統(tǒng)及新型條件內(nèi)含肽激活的Cre標(biāo)記系統(tǒng)，有望解決CreER的自發(fā)泄露問(wèn)題，從而提高可誘導(dǎo)Cre-loxP系統(tǒng)的嚴(yán)謹(jǐn)性。
　　方法：通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建可誘導(dǎo)Cre表達(dá)載體pCMV-CreER，pRIP-CreER和pMIP-CreER，檢測(cè)CMV啟動(dòng)子及胰島素啟動(dòng)子控制下CreER的泄露情況。通過(guò)點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建可誘導(dǎo)的突變型Cre

3、表達(dá)載體pCMV-CreER(H289P)和pCMV-CreER(H289T)，分析突變型CreER的自發(fā)泄露現(xiàn)象。我們還構(gòu)建膜定位Cre表達(dá)質(zhì)粒pCMV-imCre及內(nèi)含肽激活的Cre表達(dá)質(zhì)粒pCMV-ciaCre，以檢測(cè)新型可誘導(dǎo)Cre-loxP系統(tǒng)的自發(fā)泄露情況。
　　結(jié)果：我們成功構(gòu)建了可誘導(dǎo)pCMV-CreER，pRIP-CreER和pMIP-CreER表達(dá)載體，并驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)CMV，RIP及MIP啟動(dòng)子控制下CreER存在

4、嚴(yán)重泄露現(xiàn)象。通過(guò)點(diǎn)突變獲得pCMV-CreER(H289P)和pCMV-CreER(H289T)表達(dá)載體驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，減弱Cre酶活性可以明顯降低CreER的泄露，但細(xì)胞標(biāo)記效率不理想。另外，我們構(gòu)建了膜定位質(zhì)粒pCMV-imCre，染色結(jié)果表明imCre確實(shí)定位在細(xì)胞膜上，然而，該系統(tǒng)似乎沒有重組活性。我們又構(gòu)建了內(nèi)含肽激活的Cre表達(dá)質(zhì)粒pCMV-ciaCre，但目前仍未檢測(cè)到該系統(tǒng)的重組活性。
　　結(jié)論：CMV及胰島素啟動(dòng)子控