葡萄過氧化氫酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)及酶學(xué)特性的初級(jí)研究.pdf

1、過氧化氫酶(Hydrogen peroxidase)，又稱觸酶(Catalase，簡稱CAT)，是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)的末端氧化酶，是以過氧化氫為底物，通過催化一對(duì)電子的轉(zhuǎn)移而將其分解為水和氧氣。在植物中CAT清除光呼吸、線粒體電子傳遞及脂肪酸β-氧化等過程中產(chǎn)生的H2O2。大量研究表明，CAT在植物防御、脅迫應(yīng)答、延緩衰老及控制細(xì)胞的氧化還原平衡等方面起重要作用。成功構(gòu)建了葡萄過氧化氫酶(VvCAT)的表達(dá)質(zhì)粒，在畢赤

2、酵母中表達(dá)并得到純化的過氧化氫酶，從而進(jìn)一步研究過氧化氫酶的酶學(xué)特性，可以為該酶在植物新陳代謝的生理功能提供了研究基礎(chǔ)。
　　 本研究通過重疊延伸PCR技術(shù)消除VvCAT基因內(nèi)部的BamHI切點(diǎn)，根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性進(jìn)行改造。為了進(jìn)一步研究VvCAT蛋白的酶學(xué)特性，通過電擊轉(zhuǎn)化法將帶有目的基因的重組質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，添加了AOX1啟動(dòng)子使其在畢赤酵母中進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)分泌表達(dá)。對(duì)表達(dá)的葡萄過氧化氫酶使用6×His與鎳柱

3、結(jié)合的方法進(jìn)行純化與蛋白定量，通過對(duì)其進(jìn)行SDS-PAGE電泳，得到葡萄過氧化氫酶的分子量為55 KD左右。對(duì)VvCAT進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，得到其對(duì)于底物H2O2的最適反應(yīng)溫度與pH值分別為40℃和9.0，在30℃是溫度穩(wěn)定性最高，對(duì)堿性范圍內(nèi)的緩沖環(huán)境具有良好的穩(wěn)定性，對(duì)金屬離子Mn2+高度敏感產(chǎn)生抑制作用，K+、Al3+可以提高酶的活性。葡萄的過氧化氫酶對(duì)于底物過氧化氫的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值為4.806mmol/L，Vmax為102