表達H5B1血凝素HA1重組乳酸菌的構建及其免疫效力的研究.pdf

1、為研制安全、有效、方便操作的口服免疫禽流感活載體疫苗，本試驗從健康成年雞回盲腸黏膜處分離篩選到一株具有較強耐酸能力及較好上皮細胞粘附能力的雞源乳桿菌DLD17。通過分子生物學的方法，我們構建了重組H5N1血凝素乳酸乳球菌表達質粒pMG36EH和重組H5N1血凝素乳酸乳桿菌表達質粒pLEM415-pH，通過電擊轉化分離的雞源乳酸菌DLD17，乳酸乳球菌1363和嗜酸乳桿菌4356。我們獲得了穩(wěn)定表達禽流感血凝素蛋白的三株重組乳酸菌，即重組

2、乳酸乳球菌LL36EH、重組雞源乳桿菌DLD17-pH和重組嗜酸乳桿菌4356-pH。首先將三株重組乳酸菌口服免疫小鼠，及其產生的免疫效果進行了評價和比較。結果發(fā)現，重組雞源乳桿菌DLD17-pH在誘導機體產生體液免疫、細胞免疫的效果最好。因此我們選用重組雞源乳桿菌DLD17-pH口服免疫雛雞并對其免疫效果進行了評價。結果證實，重組雞源乳桿菌DLD17-pH能夠在雛雞的盲腸內定植并穩(wěn)定繁殖。它不但較早、較快的誘導呼吸道、消化道黏膜禽流感

3、特異性IgA抗體的產生，而且也能在一定程度上誘導全身性禽流感特異性IgG抗體的分泌。除此之外，重組雞源乳桿菌DLD17-pH還能激活機體細胞免疫和先天性免疫反應，增強機體免疫防御能力。因此，重組雞源乳桿菌DLD17-pH口服疫苗的研制，為預防和控制禽流感的傳播提供了新的研究思路，為宿主乳酸菌作為活載體遞送表達系統理論研究和實踐應用奠定了基礎。具體分為以下四個方面:
　　 1.雞源乳酸菌的分離、鑒定與篩選
　　 首先從健康

4、成年雞盲腸黏膜處分離了22株革蘭氏陽性菌株，設計細菌16s-rRNA細菌特異性引物，擴增每株細菌的16s片段，并與菌株信息庫比對確定菌株的種屬。再次篩選從而確定了5株雞源乳酸菌（DLD-1、DLD-5、DLD-9、DLD-13、DLD-17）用作受體轉化菌株備用。同時結合菌株生化發(fā)酵試驗，鑒定了五株雞源乳酸菌的屬種。此外，我們還對五株雞源乳桿菌的耐酸性、對Caco-2細胞粘附力以及抗生素敏感性進行測定。通過乳酸乳球菌1363和嗜酸乳桿菌

5、4356作為電擊轉化陽性對照受體菌株，以乳酸乳球菌質粒pMG36E和乳酸桿菌質粒pLEM415為空載體質粒，進行感受態(tài)的制備和電轉條件的摸索，確定了乳酸菌株轉化的最優(yōu)電擊轉化方案。獲得最優(yōu)轉化方案后，對五株雞源乳桿菌做電擊轉化篩選試驗，篩選能夠接受外源質粒的雞源乳桿菌。試驗結果證明，我們分離并篩選到的五株菌株中，一株為糞腸乳球菌DLD-1，一株為發(fā)酵乳酸桿菌（DLD-5），三株為唾液乳酸桿菌(分別為DLD-9、DLD-13、DLD-17

6、)。通過電擊轉化篩選試驗，我們得到一株雞源乳桿菌適合接受外源性質粒，即唾液乳酸桿菌DLD17。
　　 2.表達H5N1血凝素重組乳酸菌的構建及其驗證
　　 我們首先設計含有限制性內切酶SalⅠ和HindⅢ的禽流感血凝素特異性上下游引物HAF1和HAF2，PCR擴增H5N1亞型高致病性禽流感(AIV)血凝素部分片段HA1，連接pMD19T載體，測序驗證后，用限制性內切酶SalⅠ和HindⅢ分步酶切表達質粒pMG36E和克隆

7、質粒pMD19T-H，回收并連接載體骨架pMG36E與目的片段HA1，連接獲得了乳酸乳球菌表達質粒pMG36E-H;通過電擊轉化的方法，獲得重組乳酸乳球菌1363-EH（即含pMG36E-H），經SDS-PAGE和Western blot檢驗;結果表明，43KDa的血凝素蛋白在乳酸乳球菌內正確表達。同以上方法，我們也構建了重組血凝素乳酸桿菌的表達質粒pLEM415-pH。我們設計啟動子引物P1和P2，擴增乳酸菌的乳酸脫氫酶(LDH)啟動

8、子P;血凝素引物HAF1和HAF2擴增乳桿菌血凝素片段HA1，通過分子生物學酶切連接的方案，將啟動子P和血凝素基因HA1依次連接到乳桿菌空載體表達質粒pLEM415上，從而獲得了重組乳酸桿菌表達質粒pLEM415-pH。然后通過電擊轉化的方法，轉入到雞源乳桿菌DLD17和嗜酸乳桿菌4356菌株內，獲得兩株重組血凝素基因的乳酸桿菌，分別是重組雞源乳桿菌DLD17-pH和重組嗜酸乳桿菌4356-pH。通過蛋白電泳和Western-blot驗

9、證，結果表明，血凝素HA1可以在兩株重組乳酸桿菌中表達?？傊覀儷@得了三株表達禽流感血凝素的重組乳酸菌，分別為重組乳酸乳球菌LL36EH、重組雞源乳桿菌DLD17-pH和重組嗜酸乳桿菌4356-pH，為下面表達禽流感血凝素重組乳酸菌口服疫苗的研究奠定基礎。
　　 3.三株重組乳酸菌口服免疫小鼠及其免疫效果的研究
　　 運用第二章轉化獲得的三株重組乳酸菌(1363-EH、DLD7-pH、LA4356-pH)口服免疫小鼠，

10、研究小鼠呼吸道、消化道局部和全身免疫抗體水平的變化;以及分離免疫小鼠脾臟淋巴細胞，分析CD4+/CD8+、CD19+細胞亞群的變化;并在體外用血凝素HA1抗原特異性刺激來研究脾淋巴細胞增殖試驗和細胞因子IFN-γ和IL-4的分泌情況。結果發(fā)現，1363-EH、4356-pH、D(1)D7-pH三株重組乳酸菌口服免疫小鼠，免疫后1周，其均可顯著誘導腸道禽流感特異性IgA抗體的分泌;隨著時間的加長，LL36EH、4356-pH兩株免疫小鼠組

11、的特異IgA抗體水平下降，而DLD-pH株免疫產生的禽流感抗體表達隨時間增加處于穩(wěn)定水平。由此可見，三株乳酸菌均能誘導局部黏膜免疫應答。而在氣管內，僅有雞源乳桿菌DLD17-pH免疫組誘導了特異性IgA的顯著性分泌，其出現的時間比腸道晚一周。在全身性免疫反應的檢測中，我們發(fā)現三株重組乳酸菌免疫后小鼠，血清內特異性IgG抗體和HI效價都較低，其中DLD17-pH免疫組小鼠抗體滴度最高為4.5(Log2)。小鼠脾臟淋巴細胞激增殖試驗和CD4

12、+/CD8+、CD19+細胞亞群細胞的變化表明重組乳酸菌可在體內激活T淋巴細胞和B淋巴細胞;其中致敏的T淋巴細胞，主要以Th2型輔助性T細胞的增殖有關，而三株之間沒有顯著差異。由以上結果可知，三株表禽流感血凝素的重組乳酸菌，口服免疫小鼠后，在一定程度上均可刺激機體發(fā)生禽流感特異性體液、細胞免疫反應;但因菌株來源、特性的不同，免疫效果差別較大。重組雞源乳桿菌DLD17-pH在誘導機體產生體液免疫、細胞免疫的效果最好，尤其可以有效誘導腸道、

13、呼吸道黏膜特異性IgA抗體的分泌，更適合應用于家禽禽流感的黏膜免疫。
　　 4.重組雞源乳桿菌DLD17-pH口服免疫雛雞效果的研究
　　 運用第三章篩選的優(yōu)良重組雞源乳桿菌DLD17-pH口服免疫雛雞，研究雛雞呼吸道、消化道局部和全身免疫抗體水平的變化，并對重組雞源乳桿菌DLD17-pH在雛雞腸道內的定植情況進行檢測;同時與禽流感滅活疫苗的免疫效果進行比較。結果發(fā)現:口服重組雞源乳桿菌DLD17-pH，不但能誘導空腸、

14、盲腸黏膜局部特異性IgA的產生，還能夠誘導氣管處黏膜特異性IgA的產生。此外，口服重組雞源乳桿菌也能夠誘導全身特異性IgG抗體的產生，但是水平較低。與皮下免疫禽流感滅活疫苗組相比，重組雞源乳桿菌的口服免疫24h后，能顯著上調消化道、呼吸道局部組織處的細胞因子IFN-γ、模式識別受體TLR-2、防御素AvBD-9的基因表達;而下調細胞因子IL-4基因的表達。盲腸內重組雞源乳桿菌DLD17-pH數量的檢測表明，口服免疫后，重組雞源乳桿菌DL