殼聚糖材料作為支架用于中國對蝦淋巴組織細胞的體外培養(yǎng).pdf

1、蝦病的大范圍爆發(fā)使得對蝦組織和細胞體外培養(yǎng)方面的研究引起廣泛的關注。對蝦組織和細胞的體外培養(yǎng)能獲得細胞單層，但至今沒能成功建立對蝦細胞系。需要解決的關鍵問題包括培養(yǎng)體系的優(yōu)化和獲得轉(zhuǎn)化的細胞。對蝦的外殼是制備殼聚糖的原料之一，所以從某種程度上說，殼聚糖和對蝦細胞具有同源性。將殼聚糖材料用于對蝦細胞培養(yǎng)是一項開創(chuàng)性的工作，意義深遠。
　　 采用物理交聯(lián)法成功制備了殼聚糖(CS)分子量不同的殼聚糖/α,β-甘油磷酸鈉(CS/α,β-

2、GP)溫敏水凝膠。流變學實驗結(jié)果表明，CS/α,β-GP水溶液的成膠溫度隨CS的分子量增大略有增加。不同CS/α,β-GP水溶液的成膠溫度分別為：CS1/α,β-GP，25.2℃；CS2/α,β-GP，25.9℃；CS3/α,β-GP，26.2℃；S4/α,β-GP，27℃；CS5/α,β-GP，27.5℃。頻率掃描實驗的結(jié)果表明，不同溫度下，儲能模量G’和耗能模量G”隨頻率的變化情況有所不同。溫度低于成膠溫度時，體系以溶膠形式存在；溫

3、度接近或者等于成膠溫度時，溶膠開始向凝膠轉(zhuǎn)變，但是凝膠機械強度較差；溫度大于成膠溫度時，形成機械強度較好的凝膠。這一結(jié)果與試管倒置法檢驗溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變的實驗結(jié)果是一致的。SEM結(jié)果表明，溫敏水凝膠的內(nèi)部是疏松的、由不規(guī)則大孔構成的三維網(wǎng)絡結(jié)構，表面是一層結(jié)構致密完整的水化膜。Na和P元素象征著α,β-GP的存在，雙蒸水平衡以后，水凝膠中Na和P的元素降低到極低的水平，說明成膠過程中CS和α,β-GP之間沒有形成新的化學鍵生成。
　

4、　 采用傳統(tǒng)的組織塊法成功得到了原代培養(yǎng)的中國對蝦淋巴細胞。培養(yǎng)7 d能得到細胞單層，細胞逐漸由圓形變成紡錘形。培養(yǎng)25d以后，仍然可以觀察到活細胞，細胞間存在較多粘連的基質(zhì)。將中國對蝦淋巴組織接種在CS/α,β-GP溫敏水凝膠以后，熒光顯微鏡下觀察，細胞呈圓形，培養(yǎng)7 d，細胞幾乎布滿凝膠表面。通過測定原代淋巴細胞中過氧化物酶(POD)和堿性磷酸酶(ALP)活性及細胞相對活力的整體水平，我們可以知道，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，水凝膠能模擬

5、胞外基質(zhì)環(huán)境，降低對蝦淋巴細胞所受到的氧化刺激作用，并且能促進對蝦淋巴細胞的生長和增殖。綜合比較殼聚糖的分子量對淋巴細胞生長的影響，CS3/α,β-GP具有最好的培養(yǎng)效果。
　　 傳統(tǒng)的傳代方法是胰蛋白酶消化法，但是研究結(jié)果表明，對蝦細胞對胰蛋白酶具有高度敏感性，胰蛋白酶處理后細胞會受到損傷。本文采用物理方法將溫敏水凝膠破碎，使凝膠表面的細胞相互分離進而傳代。臺盼藍活細胞檢測法結(jié)果顯示，這種處理方法能夠保持細胞活性，并且細胞粘連

6、較少。連續(xù)傳代以后，對傳代細胞進行熒光染色，從熒光照片可以看出，傳至第四代，仍能觀察到活細胞，但是細胞數(shù)目顯著減少。這一現(xiàn)象既與細胞本身有關，體外培養(yǎng)的細胞需要突破M2期的限制；還可能是由于傳代過程中有細胞損失造成。采用殼聚糖酶水解溫敏水凝膠，能夠克服傳代過程中的細胞損失，但是要控制酶作用的時間。當酶在HBSS中作用4 h時，既能使細胞分離，又能保持較好的細胞活性。分散的細胞貼壁培養(yǎng)12 h后開始增殖。
　　 采用乳化交聯(lián)法成功

7、制備了殼聚糖微球(CMs)，微球的結(jié)構致密、完整，呈規(guī)則的球形，輪廓清晰，均一性好。將CMs與原代的淋巴細胞共混培養(yǎng)一定時間后，微球的輪廓變得模糊，細胞能遷移到細胞表面并生長，說明將微球用于細胞培養(yǎng)是可行的。
　　 對α,β-GP、CS/α,β-GP溫敏水凝膠和CMs進行體外細胞毒性評價。在實驗濃度范圍內(nèi)，α,β-GP對胎鼠成纖維細胞(MEF)有毒害作用。水凝膠和微球的毒性通過浸提液的細胞毒性間接反應。對于CS/α,β-GP溫敏