果樹根系硝態(tài)氮信號響應關鍵基因的克隆與功能分析.pdf

1、本試驗以桃實生苗[Prunuspersica(Linn.)Batsch.]為試材，利用高通量數(shù)字基因表達譜(DGE)技術，檢測了NO3-處理后桃苗根系轉錄組的變化，并對表達發(fā)生顯著變化的關鍵基因進行克隆與遺傳轉化、分析功能，主要研究結果如下：
　　 以10mmolL-1NO3-(N1)處理桃實生苗[生長于0.5mmolL-1NO3-(C3)桃苗為對照]，30min后取新根提取RNA，通過高通量數(shù)字基因表達譜(DGE)進行基因表達

2、分析，結果表明：1，707個基因產(chǎn)生響應。在N1中有460個基因的表達被上調；有1，247個基因的表達被下調。通過pathway分析發(fā)現(xiàn)，N1中有909個基因響應NO3-。其中81(8.91％)個基因參與氮同化和氨基酸代謝。參與氮吸收代謝和信號調控的基因[硝態(tài)氮轉運蛋白基因(NRT)，MYB、DDF和GATA類轉錄因子，蔗糖非發(fā)酵-1型蛋白激酶基因(SnRK1)和CIPK8/23同源基因]的表達發(fā)生了變化。除了參與碳、氮信號和代謝的基因

3、，NO3-還影響參與次生代謝物的生物合成、植物-病原體互作和植物生長發(fā)育等過程基因的表達。
　　 從桃樹新根克隆了PpDOF1，GenBank注冊號為HM366546。該基因全長1367bp，包含一個957bp的編碼區(qū)共編碼318個氨基酸，預測分子量為35.2KD。該基因編碼的氨基酸中含有明顯的DOF區(qū)。PpDOF1與桃基因組預測基因ppa009811m同源性最高。結果說明PpDOF1與ppa09811m可能是同一基因，但是序列

4、存在差異，可能是由于預測基因不完全正確造成的。PpDOF1在幼根、莖、葉和花中均有表達，在幼根和莖中大量表達，在葉中表達較弱，在花中的表達最弱。用5mmoolL-1NO3-處理30分鐘后PpDOF1的表達明顯上調，1小時后表達水平下降。該結果說明PpDOF1能對NO3-1產(chǎn)生響應。PpDOF1轉基因擬南芥根中全氮含量明顯高于對照(14％)，而地上部的全氮含量無明顯變化。一些參與氮信號、吸收和同化的基因，如而R398C、NRT1.8、NR

5、T1.7和NR的編碼基因表達發(fā)生了變化，說明PpDOF1可能參與調節(jié)氮代謝和信號轉導。PpDOF1轉基因擬南芥主花序前10cm內的果莢數(shù)約為16，而對照為12；并且果莢在花序上的分布表現(xiàn)出分布不均勻的特點。通過DGE技術分析轉基因擬南芥的基因表達情況發(fā)現(xiàn)，調節(jié)莖稈和花序發(fā)育的Ovatefamilyprotein(OFP)、KNOTTED1-likehomeobox(KNOX)genes和BEL1-like(BELL)homeodomai

6、nproteins類基因的表達均發(fā)生了不同程度的變化。轉基因擬南芥37個參與脂類轉運和代謝的基因的表達也發(fā)生了變化(其中13個被上調，24個被下調)。
　　 蔗糖非發(fā)酵-1-型相關蛋白激酶-1(SnRK1)編碼基因能對根際NO3-信號產(chǎn)生應答，為此對本實驗室已獲得的2個MhSnRK1超表達番茄株系(T2-7，T2-9)進一步進行研究，結果表明：葉片SnRK1活性增加了15％-16％。轉基因番茄光系統(tǒng)Ⅰ蛋白PsaF和光系統(tǒng)Ⅱ蛋白P

7、sbR編碼基因的表達上調，Rubisco甲基轉移酶編碼基因的表達下調；葉片的光合速率也有明顯提高。葉片SPS和SS合成方向的活性無明顯變化；相反，SS分解方向的活性明顯上升，T2-7的SS分解方向比野生型上升了36％。AGPase活性增加了45％左右；可溶性糖和淀粉含量都比野生型高，而且葉片中淀粉日變化較野生型劇烈。T2-9葉片和果實中可溶性糖含量分別增加了30％-40％。轉基因番茄果實中AsA和可滴定酸含量均有明顯降低。T2-9果實中

8、AsA和可滴定酸含量分別下降為野生型的80％和66％。轉基因番茄中可溶性蛋白和NR活性明顯降低；15N示蹤的研究表明，氮肥吸收效率升高。
　　 NO3-轉運蛋白(NRT)不僅負責植物NO3-的運輸還能響應根際NO3-信號，有研究表明AtNRT1.1可能是NO3-信號感受器。根據(jù)GenBank上注冊的蘋果中NRT的EST序列設計特異引物，克隆了三個平邑甜茶NO3-轉運蛋白全長基因，分別命名MhNRT1.5、MhNRT2.1和MhN

9、RT2.5，GenBank注冊號分別為FJ437208；FJ168536；FJ168537。這三個基因分別編碼583、583和504個氨基酸，預測分子量為64.75、57.27和54.51KD。亞細胞定位預測發(fā)現(xiàn)它們編碼的蛋白都定位在質膜上。采用實時熒光定量PCR研究它們的表達量的變化，結果表明：三個基因在平邑甜茶各個器官均有表達。根際施用NO3-后三個基因的表達都開始增加，除了10mmolL-1NO3-處理的MhNRT1.5和MhNR

10、T2.5在4h后達到最大值外，其它均在12h達到最大值。由此可見，MhNRT1.5、MhNRT2.1租MhNRT2.5的表達受NO3-的誘導。MhNRT1.5和MhNRT2.1轉基因擬南芥葉片中NO3-含量均有所上升。通過對表現(xiàn)型的觀察發(fā)現(xiàn)MhNRT1.5轉基因擬南芥主花序的果莢密度也明顯大于對照。MhNRT1.5轉基因擬南芥主花序前10cm內的果莢數(shù)約為18，而對照為12。與PpDOF1轉基因擬南芥表現(xiàn)型不同的是：果莢分布相對比較均勻