YHeml基因轉(zhuǎn)化香蕉提高其抗冷性的研究.pdf

1、香蕉是世界上最重要的熱帶和亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物之一。低溫是影響香蕉品質(zhì)、產(chǎn)量及種植范圍的重要限制因子。栽培香蕉多為三倍體，不能形成可育的種子，因而，通常只能依靠無性繁殖。這一特殊的生物學(xué)特性使其很難利用傳統(tǒng)的實(shí)生育種方法進(jìn)行遺傳改良。相反，近年來組織培養(yǎng)技術(shù)和基因工程技術(shù)的出現(xiàn)使香蕉的品種改良得以實(shí)現(xiàn)且更加容易。
　　人們早就發(fā)現(xiàn)，在植物體內(nèi)普遍存在著5-氨基乙酰丙酸(ALA)。上世紀(jì)末，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，低濃度ALA能夠調(diào)節(jié)植物生長

2、發(fā)育，提高作物產(chǎn)量，增強(qiáng)作物抗逆性。前人創(chuàng)造性地將擬南芥HemA1基因光敏型啟動(dòng)子與釀酒酵母菌ALA合酶編碼基因Hem構(gòu)建在一起，形成一個(gè)光控制的Hem1基因(YHem1)。將YHem1轉(zhuǎn)入煙草、擬南芥以及草莓等作物中，可以提高植物葉片光合能力，增加植株耐鹽性。但是YHem1是否能夠轉(zhuǎn)入香蕉，并且提高植株耐冷性的研究尚未見有報(bào)道。本研究擬將YHem1基因轉(zhuǎn)入香蕉假莖薄片中，通過優(yōu)化再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系，篩選抗性不定芽，通過GUS染色與

3、分子檢測，獲得轉(zhuǎn)基因香蕉植株。所獲得的主要結(jié)果如下。
　　1.以‘巴西’香蕉(Musananacv.‘Brazil’)假莖橫切薄片為外植體，通過對植物生長調(diào)節(jié)劑、外植體和暗培養(yǎng)時(shí)間比較，優(yōu)化了香蕉不定芽再生體系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)條件下香蕉薄片再生率最高可達(dá)到95％，首先要選擇5代以前的香蕉植株，其次在MS基本培養(yǎng)基中附加0.1mg/LNAA、3mg/L6-BA和2.0mg/LAgNO3，最后要經(jīng)過2周的暗培養(yǎng)時(shí)間。將得到的長至

4、2-3cm的不定芽切下置于MS+0.4mg/LNAA的生根培養(yǎng)基中生根可得到完整的植株。
　　2.在上述再生體系基礎(chǔ)上，研究了影響香蕉遺傳轉(zhuǎn)化的幾個(gè)因素，如:浸染輔助方法、Km濃度以及共培養(yǎng)條件等，優(yōu)化了香蕉遺傳轉(zhuǎn)化體系。研究結(jié)果表明:在含有擬南芥emA1基因啟動(dòng)子控制的釀酒酵母ALA合酶基因(Hem1)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌液(OD600=0.8～1)中侵染30min（震蕩侵染10min靜置20min），且在添加100μmol/LAS和2

5、mg/LPro的共培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)4～6d，250mg/L卡那霉素和500mg/L羧芐青霉素篩選3周，獲得了7株卡那霉素抗性植株。
　　3.利用以上實(shí)驗(yàn)得到的香蕉再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系，共得到15個(gè)抗性芽（抗性芽再生率約為20％），7株香蕉抗性苗，經(jīng)GUS染色檢測得到5株GUS+植株;經(jīng)PCR檢測證明3株苗同時(shí)轉(zhuǎn)入了HemA1啟動(dòng)子基因和HemⅠ目的基因;經(jīng)過RT-PCR檢測YHemⅠ在其中的2株中得到過量表達(dá)。內(nèi)源ALA含量測定表明，

6、轉(zhuǎn)基因植株可以過量合成ALA，其內(nèi)源ALA含量顯著高于野生型植株。
　　4對轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株在25℃常溫和7℃低溫脅迫1.5h后的香蕉葉片葉綠素相對含量(SPAD)、快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線(OJIP)及820nm光吸收曲線分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的SPAD值顯著高于野生性植株。低溫脅迫后，野生型的OJIP相明顯下降，但轉(zhuǎn)基因株系各相仍保持了較高的熒光值;利用多功能植物效率儀(M-PEA)測定結(jié)果表明，低溫脅迫前后，轉(zhuǎn)基因香蕉