荒漠植物H+-Ppase基因的系統(tǒng)發(fā)育分析及SaVP1和KcNHX1基因的功能鑒定.pdf

1、非生物脅迫是導(dǎo)致作物減產(chǎn)甚至植株死亡的重要因素。在非生物脅迫因子中，高溫、干旱和鹽堿是最常見、最廣泛的影響植物生長、發(fā)育、生殖及產(chǎn)量等各個方面的逆境因子。高溫和干旱主要對植物造成氧化脅迫和滲透脅迫，而鹽脅迫主要對植物造成離子毒害和滲透脅迫。所有的逆境因子最終都會通過破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、損害胞內(nèi)的生理功能從而影響植株的生長和發(fā)育。如何讓植物在高溫、干旱、鹽堿等逆境條件下完成生活史并保持相應(yīng)的產(chǎn)量成為目前亟待解決的問題。本研究從幾種荒漠植物中克隆

2、了抗逆相關(guān)基因H+轉(zhuǎn)運無機(jī)焦磷酸酶(H+-PPase)基因和液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因(NHX），并對H+-PPase基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了分析，同時對來自苦豆子的H+-PPase和花花柴的NHX基因功能進(jìn)行了研究，取得的主要結(jié)果如下:
　　1、克隆了來自新疆塔里木盆地7種荒漠植物的H+-PPase基因，并對其系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了分析。
　　本研究從荒漠植物苦豆子（SophoraalopecuroidesL.）、烏拉爾甘草（

3、GlycyrrizaUralensisFisch.）、脹果甘草(GlycyrrhizainflataBat)、鹽穗木(GlycyrrhizainflataBay)、鹽地堿蓬(Suaedasalsa)、硬枝堿蓬（Suaedarigida）和花花柴（Kareliniacaspica）7種荒漠植物中克隆得到了6條H+-PPase基因全長和8條H+-PPase基因片段序列。通過與NCBI數(shù)據(jù)庫中已鑒定的240余條H+-PPase基因比對發(fā)現(xiàn)，新

4、獲得的這些基因除了具有H+-PPase家族特有的保守結(jié)構(gòu)域外，該基因家族可能還存在兩個新的保守結(jié)構(gòu)域。利用17條來自與本研究所選材料親緣關(guān)系較近的植物Ⅰ型H+-PPase基因、8條來自藻類、細(xì)菌和原生動物的Ⅰ型H+-PPase基因及9條Ⅱ型H+-PPase基因與本研究新克隆的14條基因進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。聚類結(jié)果顯示新克隆的14條基因可能都屬于Ⅰ型H+-PPase基因。通過對上述H+-PPase基因編碼蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，高等植物

5、的Ⅰ型基因都以二聚體的形式存在，而所有的Ⅱ型基因以及來自低等生物的Ⅰ型基因則以單體的形式存在。SaVP3蛋白也以單體的形式存在，并與其他H+-PPase基因的同源性較低，因此推測SaVP3可能屬于Ⅱ型H+-PPase基因或一類新的H+-PPase基因。這可能是由不同物種之間的基因交流所致，或者SaVP3和SaVP1基因可能是一對旁系同源基因。H+-PPase基因在進(jìn)化上的高度保守性表明其對生物體功能的重要性，同時也表明這類基因在生物進(jìn)化

6、過程中所受的環(huán)境選擇壓力較小;H+-PPase基因家族的這些特點這對進(jìn)一步研究其進(jìn)化起源、基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供了重要的參考。
　　2、SaVP1基因不僅能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的耐旱耐鹽性，還具有耐高溫的功能。
　　將來自荒漠植物苦豆子的SaVP1基因在擬南芥中超表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對干旱、高鹽及高溫的耐受性都強(qiáng)于野生型。在干旱和鹽處理下，轉(zhuǎn)基因植株中SOD酶活增強(qiáng)、MDA的含量降低，使得轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性明顯強(qiáng)于野生型。將

7、苗期的擬南芥在30-38℃處理4天后轉(zhuǎn)基因植株的存活率在85％以上，而野生型僅為33％;而將結(jié)實期的植株在33℃處理1周后，轉(zhuǎn)基因植株的結(jié)實性為野生型的2倍。這可能是在高溫條件下SaVP1的超量表達(dá)增加了植株體內(nèi)可溶性糖的積累以及POD的酶活，降低了MDA的含量;轉(zhuǎn)基因植株在高溫下的結(jié)實性也高于野生型，可能與SaVP1基因的超表達(dá)能夠維持高溫條件下花器官中較高的IAA含量有關(guān)。IAA的測試結(jié)果也說明在高溫條件下轉(zhuǎn)基因植株的花器官中IAA

8、含量幾乎是野生型的2倍，外施IAA的結(jié)果表明IAA的補(bǔ)充確實能部分恢復(fù)高溫條件下的結(jié)實性，說明高溫引起的結(jié)實性下降確實與IAA含量降低有關(guān)，而SaVP1的超表達(dá)能增加花器官中IAA的含量。同時在高溫條件下，轉(zhuǎn)基因植株葉片的氣孔開度也明顯增加，而且與K+和Ca2+相關(guān)的轉(zhuǎn)運體基因的表達(dá)也明顯上調(diào)，這些結(jié)果與轉(zhuǎn)SaVP1基因植株具有耐旱、耐鹽及耐高溫的表型相吻合。
　　3、KcNHX1基因具有廣譜抗逆性功能。
　　從荒漠植物花花

9、柴中克隆了液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因（KcNHX1），并對其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)KcNHX1蛋白具有10次跨膜結(jié)構(gòu)，pI值為6.27，分子量約為60kD。和SaVP1基因相似，將該基因在擬南芥中超表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株對干旱、高鹽及高溫的耐受性都強(qiáng)于野生型。苗期高溫處理的結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株的存活率在88％以上，而野生型僅為18％;結(jié)實期在33℃處理1周后，轉(zhuǎn)基因植株的結(jié)實性為野生型的2倍。而且在高溫條件下KcNHX1的超

10、量表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株P(guān)OD的酶活、增加了可溶性糖的積累、且MDA的含量降低，增加了花器官中IAA的含量，轉(zhuǎn)基因植株在高溫下的結(jié)實性也高于野生型。外施IAA結(jié)果表明IAA的補(bǔ)充確實能部分恢復(fù)高溫條件下的擬南芥的結(jié)實性，說明KcNHX1的超表達(dá)能增加花器官中IAA的含量。同時在高溫條件下，轉(zhuǎn)基因植株葉片的氣孔開度明顯增加，而且與K+和Ca+相關(guān)的轉(zhuǎn)運體及離子通道蛋白基因的表達(dá)也明顯上調(diào)，說明KcNHX1基因具有耐高溫、耐旱、耐鹽的功能。<