小鵝瘟病毒W(wǎng)h-12株的分離鑒定及其雙抗夾心ELISA檢測方法的建立.pdf

1、小鵝瘟(GP)也被稱為Derzsy's病，是由小鵝瘟病毒(學(xué)名為鵝細(xì)小病毒，Gooseparvovirus，GPV)引起的一種主要侵害雛鵝和雛番鴨的高度接觸性傳染病。該病傳播速度快，死亡率和發(fā)病率均高達(dá)90％～100％，隨著雛鵝日齡的增長，發(fā)病率和死亡率都有所下降，其主要特征是小腸粘膜表層大片壞死脫落與滲出物凝成假膜栓子物堵塞于小腸，最大發(fā)病日齡為60日齡，其后常成隱性感染。本病一年四季均可發(fā)生流行，具有一定的季節(jié)性和周期性。目前，該病

2、已成為危害養(yǎng)鵝業(yè)和養(yǎng)番鴨業(yè)中最主要傳染病之一，給養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失。
　　本研究對疑似小鵝瘟臨床病例進(jìn)行了病原的分離鑒定，豐富了小鵝瘟的流行病學(xué)及病原學(xué)資料，為臨床診斷提供依據(jù)。在病原分離鑒定的基礎(chǔ)上，擴增了該分離株的全基因序列，進(jìn)行了序列分析，為小鵝瘟病毒分子流行病學(xué)的的研究提供依據(jù)。此外，本研究通過構(gòu)建重組質(zhì)粒，表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白VP3，建立了小鵝瘟病毒雙抗夾心ELISA檢測方法，旨在為基層防疫單位及流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)手段。

3、r>　　主要研究內(nèi)容:對來自安徽省五河縣某養(yǎng)殖場所送檢的病死和瀕死小鵝進(jìn)行的實驗室檢測，通過流行病學(xué)、臨診觀察和剖檢病變的檢查，初步疑為小鵝瘟;同時，對病例的肝、脾、心、腦、腎等組織進(jìn)行細(xì)菌學(xué)初檢和病原學(xué)（細(xì)菌學(xué)和病毒學(xué)）的分離與病料的保存，并采用血凝試驗、瓊擴試驗、PCR方法、動物回歸試驗等方法對該病原分離物進(jìn)行鑒定，確診為小鵝瘟病毒，命名為GPVWH-12株。根據(jù)GenBank中已公開發(fā)表的8株小鵝瘟病毒基因組序列，通過DNAsta

4、r軟件進(jìn)行序列對比，以同源性最高的JF333590序列分別設(shè)計并合成可覆蓋其全序列的4對引物，分別進(jìn)行PCR擴增、凝膠電泳鑒定和克隆與測序，用DNAStar軟件將GPV各片段的測序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到GPVWH-12的全基因組序列，在NCBI上進(jìn)行BLAST比對和DNAStar軟件作同源性分析，結(jié)果表明GPVWH-12株與KC478066株在同一分支中，其推導(dǎo)的核苷酸序列同源性也最高，達(dá)99.6％，而與HQ891825株的同源性最低，為9

5、3.8％。此外，根據(jù)JF333590設(shè)計并合成可完全覆蓋結(jié)構(gòu)蛋白VP3基因的引物，擴增1605bp的GPVVP3基因片段，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pColdI-VP3并進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化和抗HIS標(biāo)簽的抗體進(jìn)行Western-blot鑒定，用該蛋白免疫新西蘭白兔制備多克隆抗體，經(jīng)純化與生物活性的鑒定后進(jìn)行雙抗夾心ELISA的小鵝瘟抗原檢測方法的建立，并從包被液、酶標(biāo)二抗、封閉時間、顯色時間、敏感性等方面進(jìn)行優(yōu)化，最后對其特異性、敏感性和PC