通過斑馬魚模型研究霍亂弧菌致病相關(guān)基因?qū)ζ湓谥虚g宿主腸道定殖能力的影響.pdf

1、霍亂弧菌（Echolerae）是一種革蘭氏陰性、兼性厭氧、水生的弧菌，同時也是人類烈性傳染病霍亂的病原體。目前對霍亂弧菌在實驗室條件和致病條件下基因表達調(diào)控的研究較為詳細，但對其在自然水體中的生存情況及相關(guān)基因的表達調(diào)控研究較少，主要是由于缺少合適的模型?；魜y弧菌在淡水中一般不能獨立生活，需要附著在水生動、植物體表才能生存，因此魚類可能是霍亂弧菌的中間宿主之一。而斑馬魚（Daniorerio）模型是研究與動物相關(guān)的微生物在活體條件下生長

2、或致病的一種相對簡單和方便的動物模型。
　　為了建立斑馬魚模型研究自然條件下霍亂弧菌的生存和定殖情況，本文將斑馬魚放在含有約1×105CFU/mL霍亂弧菌的水中，發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌在24h內(nèi)就能在斑馬魚的腸道中定殖。
　　首先，通過霍亂弧菌毒力調(diào)控相關(guān)基因的缺失突變株與野生型菌株的競爭定殖實驗，發(fā)現(xiàn)△luxO和△aphA突變株的競爭系數(shù)與其它突變株相比差異最大，分別為0.122和7.655，說明這兩個基因的缺失對霍亂弧菌在斑馬魚體

3、內(nèi)定殖能力影響最大;但是在乳鼠模型中，aphA的缺失突變株在腸道定殖的能力小于野生型菌株。同時與群體感應(yīng)相關(guān)基因的缺失對霍亂弧菌在斑馬魚模型中定殖能力的影響遠遠小于在乳鼠模型中，因此毒力調(diào)控相關(guān)基因的缺失對霍亂弧菌在斑馬魚體內(nèi)定殖能力的影響較小。
　　其次，在單獨定殖實驗中，△toxT突變株的定殖數(shù)量與野生型菌株相當(dāng)，說明毒素共調(diào)節(jié)菌毛(TCP)并沒有在斑馬魚體內(nèi)表達，因此對其在斑馬魚體內(nèi)定殖沒有影響，這是與霍亂弧菌在乳鼠小腸中定

4、殖時區(qū)別最大的地方，推測霍亂弧菌在斑馬魚體內(nèi)定殖以生存、增殖為主要目的。綜合比較基因缺失突變株和野生型菌株在單獨和競爭定殖實驗中的定殖情況，發(fā)現(xiàn)△hapR突變株（該菌株在兩種情況下定殖數(shù)量沒有顯著性差異）在競爭定殖實驗中使野生型菌株的數(shù)量比其在單獨定殖時增加了11倍;而野生型菌株（該菌株在兩種情況下定殖數(shù)量沒有顯著性差異）使△aphB突變株的數(shù)量比單獨定殖時下降了54倍。說明不同基因的缺失對霍亂弧菌在中間宿主體內(nèi)與其它菌株的競爭時產(chǎn)生不

5、同的影響，這對揭示霍亂弧菌在自然條件下的生存機制提供了新的思路。
　　最后，本文選取了LuxR家族、LysR家族以及胞外蛋白酶家族中一些基因缺失突變株，研究它們在斑馬魚體內(nèi)定殖的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LuxR家族的vc1277基因缺失突變株在斑馬魚體內(nèi)定殖能力比野生型菌株提高了4.548倍，且有研究表明斑馬魚腸道能產(chǎn)生AHLs類信號分子，該分子是LuxR蛋白的誘導(dǎo)物，它可與LuxR蛋白結(jié)合從而影響其下游基因的表達。在LysR家族蛋白中，△

6、oxyR突變株在單獨接種實驗中的定殖數(shù)量比野生型菌株降低了約16倍，但是當(dāng)二者競爭定殖時，ΔoxyR突變株與野生型菌株的定殖數(shù)量無顯著性差異，而相同的試驗在乳鼠模型下則沒有任何差異，說明OxyR調(diào)控氧代謝相關(guān)基因的表達對霍亂弧菌在斑馬魚體內(nèi)抵抗ROS的過程中發(fā)揮了作用。而在胞外蛋白酶基因缺失突變株中，基因vc0524、vca0849和vca0812編碼的蛋白酶對于霍亂弧菌在斑馬魚體內(nèi)定殖起到了抑制作用。同時，△prtV突變株在水體中比野