霍亂弧菌oxyR突變株生長缺陷機(jī)制的研究.pdf

1、霍亂是一種古老且流行廣泛的急性腸道感染疾病，臨床表現(xiàn)為大量米泔樣大便，嚴(yán)重時候?qū)е虏∪诵菘松踔了劳?。革蘭氏陰性細(xì)菌霍亂弧菌是引起霍亂的病原體，其致病能力主要由霍亂毒素和毒素共調(diào)節(jié)菌毛所介導(dǎo)。
　　 LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是廣泛存在于原核生物中的一類DNA結(jié)合蛋白家族，該家族蛋白雖然結(jié)構(gòu)高度保守，但調(diào)控范圍涉及生物代謝、群體感應(yīng)、毒素產(chǎn)生、固氮和游動性等多方面?？寡趸{(diào)節(jié)子OxyR是LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白家族的成員之一，大小約34

2、 KDa，是菌株抵抗氧化損傷作用的最重要的防御屏障。對于OxyR調(diào)節(jié)子的研究在大腸桿菌、綠膿桿菌等細(xì)菌中進(jìn)行得比較廣泛和深入，而在霍亂弧菌中尚未有研究報道，因此本實驗以霍亂弧菌OxyR調(diào)節(jié)子作為研究對象。
　　 采用框內(nèi)敲除方法構(gòu)建霍亂弧菌oxyR突變株，發(fā)現(xiàn)有氧條件下培養(yǎng)時該突變株具有嚴(yán)重的生長缺陷，而霍亂弧菌野生株的培養(yǎng)物上清液可以彌補(bǔ)這種生長缺陷，使oxyR哭變株恢復(fù)正常生長;繼而通過一系列實驗證明上清液中發(fā)揮作用的的活性

3、物質(zhì)是與抗氧化相關(guān)的蛋白質(zhì)，同時檢測到牛肝過氧化氫酶也具有彌補(bǔ)oxyR突變株生長缺陷的活性，推測有氧條件下霍亂弧菌oxyR突變株的生長缺陷是由外界環(huán)境中的氧分壓所導(dǎo)致，上清液中發(fā)揮作用的的活性物質(zhì)可能是與抗氧化相關(guān)的酶類。
　　 構(gòu)建霍亂弧菌中幾種抗氧化功能基因（katG、katB、vc2637-8)的缺失突變株，檢測突變株上清液是否能夠幫助oxyR突變株恢復(fù)正常生長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KatG、KatB蛋白是存在于上清液中的主要活性物質(zhì)

4、;利用鎳柱純化帶有His標(biāo)簽的KatG、KatB融合蛋白并添加到oxyR突變株的培養(yǎng)液中，證實了二者確實具有彌補(bǔ)oxyR突變株生長缺陷的活性;以lux作為報告基因構(gòu)建目的基因表達(dá)分析的檢測菌株，通過冷光檢測發(fā)現(xiàn)OxyR對katG、katB的表達(dá)不具有調(diào)控作用，因此證明了為何oxyR突變株上清液具有與野生株上清液相同的彌補(bǔ)oxyR突變株生長缺陷的功能;通過在霍亂弧菌體內(nèi)超量表達(dá)帶有Flag標(biāo)簽的KatG、KatB融合蛋白，以霍亂弧菌確定的

5、胞內(nèi)蛋白HapR作為對照，通過Western blotting檢測證實這兩個蛋白均是通過細(xì)胞裂解方式釋放到上清液中從而發(fā)揮作用的。
　　 論文進(jìn)一步研究了霍亂弧菌oxyR、katG、katB、vc2637-8等抗氧化基因缺失株的生理功能。通過檢測生長情況，發(fā)現(xiàn)除oxyR缺失導(dǎo)致菌株嚴(yán)重的生長缺陷之外，katG-kat B-vc2637-8三重基因缺失突變株的生長也會受到一定程度的抑制;通過檢測突變株對H2O2的敏感性，發(fā)現(xiàn)抗氧化