廣東省霍亂弧菌分子進(jìn)化與變異研究.pdf

1、霍亂是由霍亂弧菌（Vibrio Cholerae，VC）引起的以急性水樣便為主要特征的腸道傳染病。
　　霍亂腸毒素CT是霍亂弧菌最重要的致病因子，其編碼基因?yàn)閏txAB，是目前已知的致泄毒素中最強(qiáng)烈的毒素。攜帶ctxAB基因的霍亂弧菌稱為產(chǎn)毒株，是引起霍亂暴發(fā)流行的主要病原體，而不攜帶ctxAB基因的霍亂弧菌非產(chǎn)毒株對人不致病或偶然有些菌株引起腹瀉，一般不引起霍亂的暴發(fā)和流行。研究發(fā)現(xiàn)，O1群和O139群霍亂弧菌產(chǎn)毒株的基因組相對

2、比較保守，第七次霍亂世界大流行期間分離的O1群埃爾托型霍亂弧菌產(chǎn)毒株的基因組僅存在細(xì)微的變化，這些變化隨時間的推移慢慢地累積，而O1群和O139群非產(chǎn)毒株的基因組則表現(xiàn)出明顯的遺傳多樣性。這些研究基礎(chǔ)將為我們進(jìn)一步使用更高分辨率的分子分型方法去研究霍亂弧菌產(chǎn)毒株的進(jìn)化和變異特征提供基礎(chǔ)。
　　細(xì)菌分型是推斷菌株間關(guān)系的常用方法，可用于重新構(gòu)建種系進(jìn)化關(guān)系、描述菌群結(jié)構(gòu)，也可以用于傳染病暴發(fā)的溯源分析。細(xì)菌分型早期主要依靠形態(tài)學(xué)方法

3、，如血清分型、噬菌體分型、毒素分型及抗生素耐藥譜等。近年來，基于DNA序列分析的分子分型成為主要的技術(shù)。其中，脈沖場凝膠電泳技術(shù)（Pulsed field gel electrophoresis，PFGE）是當(dāng)前細(xì)菌分子分型的主流技術(shù)，通過限制性內(nèi)切酶消化細(xì)菌基因組后產(chǎn)生的DNA指紋圖譜進(jìn)行暴發(fā)識別和溯源分析。此外，多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)和多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(Mult

4、ilocus variable-number tandem repeat analysis，MLVA)等分子分型方法，通過互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫大大簡化和方便了不同實(shí)驗(yàn)室間的數(shù)據(jù)交流與共享，有利于快速進(jìn)行大范圍的暴發(fā)調(diào)查和溯源分析。但是，這些分型方法僅反映了病原菌基因組的局部遺傳信息，分辨力有限，對于高度克隆化的菌株，或進(jìn)行大時間跨度的流行病學(xué)研究稍顯不足。全基因組測序(Whole-genome sequencing，WGS)分型，可在全基因組堿

5、基序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行流行病學(xué)分析，全面反映了病原菌的遺傳與變異特征，大大提高了菌株進(jìn)化和溯源分析的分辨力，有助于快速地確認(rèn)并追蹤到病原體。
　　本研究選取廣東省1961-2013年50多年間從霍亂病例分離的381株O1群（稻葉型148株，小川型233株）和136株O139群霍亂弧菌代表性菌株進(jìn)行血清分型、毒力基因PCR檢測、ctxB和tcpA基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序分型和PFGE分子分型，以全面了解和掌握我省霍亂弧菌基本的菌型分布和分子特征

6、，然后根據(jù)PFGE指紋圖譜、ctxB和tcpA基因分型結(jié)果，選擇154株代表性的菌株進(jìn)行全基因組測序分型。將這154株代表菌株的全基因組序列與另外126株國內(nèi)其它省份代表株和107株國際代表株的全基因組序列進(jìn)行基于全基因組的單核苷酸多態(tài)性鑒定(wg-SNPs)和構(gòu)建最大似然樹，以此深入分析我省霍亂弧菌基因變異情況，并結(jié)合流行病學(xué)資料，構(gòu)建我省霍亂弧菌種系發(fā)生關(guān)系，推斷病原體的進(jìn)化過程，從分子遺傳的角度闡明我省不同時期霍亂的流行特點(diǎn)，從分

7、子機(jī)制上深入理解我省霍亂弧菌菌株變遷進(jìn)化和變異規(guī)律，為今后霍亂弧菌分子流行病學(xué)監(jiān)測、暴發(fā)識別和精確溯源分析提供研究基礎(chǔ)。
　　目的:
　　1.系統(tǒng)地了解和掌握1961年廣東省首次暴發(fā)O1群埃爾托型霍亂，至2013年期間，我省O1群和O139群霍亂弧菌病例分離株的血清型別轉(zhuǎn)換分布規(guī)律、主要毒力基因攜帶和PFGE分子分型特征;
　　2.在全基因組的水平上，分析我省O1群和O139群霍亂弧菌遺傳進(jìn)化和變異特征，構(gòu)建我省霍亂弧

8、菌種系發(fā)生關(guān)系，摸清我省不同流行階段霍亂弧菌的傳染來源和流行路線等分子流行特征。為構(gòu)建廣東省霍亂弧菌分子溯源數(shù)據(jù)庫，建立基于wg-SNPs的高分辨力的霍亂弧菌分子流行病學(xué)監(jiān)測、暴發(fā)識別和溯源分析體系提供依據(jù)。
　　內(nèi)容與方法:
　　1.文獻(xiàn)調(diào)查研究:通過文獻(xiàn)調(diào)研的方式查閱1961年以來廣東省霍亂流行史料，并根據(jù)霍亂監(jiān)測資料和流行特征，將1961年以來廣東省霍亂流行分為4個時期，根據(jù)不同流行時期，不同地區(qū)，癥狀的輕重以及不同的

9、血清亞型選取代表性病例菌株517株，其中O1群霍亂弧菌381株（小川型233株，稻葉型148株），O139群霍亂弧菌136株。
　　2.菌株復(fù)蘇和復(fù)核鑒定:用普通營養(yǎng)肉湯對凍干菌株進(jìn)行復(fù)蘇，并用普通API生化鑒定和血清分型對菌株進(jìn)行再鑒定、以核實(shí)菌株的型別。
　　3.菌株毒力基因檢測:采用QIAgen DNA minikit試劑盒進(jìn)行菌株核酸提取，并采用普通PCR的方法對菌株的ctxB，ace，zot，tcpA，tcpI，h

10、lyA，ompU，rtxC和st等常見霍亂毒力基因進(jìn)行PCR定性檢測，對ctxB和tcpA基因陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分型。
　　結(jié)果:
　　1.流行分布特征:
　　1961年首次暴發(fā)O1群埃爾托型霍亂，至2013年期間，廣東霍亂流行可分成4個流行期，每一個流行期都與一個優(yōu)勢菌型相關(guān)，且具有相對獨(dú)特的流行病學(xué)特征。其中，第一次流行期（1961-1969年）的優(yōu)勢菌型是O1群小川型;第二次流行期（1978-1989年）優(yōu)勢

11、菌型為O1群稻葉型;第三次流行期(1990-1999年)優(yōu)勢菌型為O1群小川型;第四次流行性（2000-2013年）以小型暴發(fā)和散發(fā)為主，優(yōu)勢菌型為O1群稻葉型。而1993年出現(xiàn)的O139群霍亂弧菌，至今近20年間，主要以散發(fā)和小型暴發(fā)為主，從未引起大規(guī)模的暴發(fā)流行。
　　2.毒力基因攜帶情況:
　　1)381株O1群埃爾托霍亂弧菌中，有367株同時攜帶了ctxB，ace和zot基因，374株攜帶了tcpA基因，其余14株為

12、ctxB，ace和zot基因陰性。PCR產(chǎn)物測序分析發(fā)現(xiàn)，1992年以及之前分離到的160株為埃爾托型ctxB，1993年及以后分離的207株中，除1株為埃爾托型ctxB外，其余的均為古典型ctxB，而所有tcpA基因均為埃爾托基因型。
　　2)136株O139群霍亂弧菌中，有123株同時攜帶了ctxB，ace和zot基因，123株攜帶了tcpA基因，其余10株為ctxB，ace和zot基因陰性。PCR產(chǎn)物測序分析發(fā)現(xiàn)，113株為

13、ctxB基因3型（埃爾托型），7株為ctxB基因1型（古典型），3株為ctxB基因5型，而所有tcpA基因均為埃爾托型。
　　結(jié)論:
　　1.1961-2013年，廣東省霍亂流行具有階段性的特征，根據(jù)每一階段的流行病學(xué)特征和病原學(xué)特征，可大致分成四個流行期，每一個流行期都與一個優(yōu)勢菌型相關(guān):第一次流行期為小川型（1961-1964年），第二次流行期為稻葉型（1978-1989年），第三次流行期又是小川型（1990-1999年

14、），第四次流行期主要是稻葉型（2000-2013年），這種優(yōu)勢菌型的變換與我國其他地方以及周邊亞洲國家的變化態(tài)勢類似。
　　2.1992年之前的分離O1群霍亂弧菌均攜帶埃爾托型ctxB等位基因ctx BElTor，而1992年之后的分離的O1群霍亂弧菌均攜帶古典型ctxB等位基因ctx Bclassical，這個等位基因的變化與我國其他的地方，以及亞洲、非洲和拉丁美洲霍亂弧菌的變化一致。
　　3.O139群分離株基本上都是c

15、txB基因3型，即埃爾托型。在本研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)在O139群霍亂弧菌發(fā)現(xiàn)ctxB基因1型（古典型）和基因5型，這表明，ctxB基因的變異不僅僅發(fā)生在O1群霍亂弧菌上，O139群霍亂弧菌同樣可能出現(xiàn)這種非埃爾托型的變異。
　　4.381株O1群霍亂弧菌PFGE指紋圖譜可聚類成5個cluster，高度相關(guān)的菌株均來自同一個流行期，提示每一次大流行期的開始，均是由一個新的變異株的引入。
　　5.PFGE指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)，O13

16、9群霍亂弧菌產(chǎn)毒株維持著相對緊密的克隆群，從不同地區(qū)分離到的菌株之間的遺傳關(guān)系相近，而非產(chǎn)霍亂腸毒素的O139群霍亂弧菌則表現(xiàn)出豐富的多樣性和多克隆譜系。
　　6.全基因組單核苷酸多態(tài)性分析顯示，我省病例分離的O1/O139群霍亂弧菌產(chǎn)毒株在遺傳學(xué)上顯示出高度單態(tài)性，菌株之間的差異絕大多數(shù)是由突變所導(dǎo)致。
　　7.在O1群霍亂弧菌的某些進(jìn)化分支上，我省分離的菌株出現(xiàn)單獨(dú)聚集成簇的現(xiàn)象，體現(xiàn)出一定的地域聚集性，該現(xiàn)象可能因這些