廣東省01-0139群霍亂弧菌耐藥分析研究.pdf

1、霍亂是由霍亂弧菌引起的烈性腸道傳染病，以發(fā)病急、傳播快、波及范圍廣、能引起大流行為特征。新中國成立以來，尤其是進(jìn)入二十世紀(jì)九十年代以來，我國的愛國衛(wèi)生運動和農(nóng)村改水改廁工作卓有成效，霍亂弧菌通過水源傳播的情況得到了極大的改善和控制。但是，近年來，因生食或半生食受霍亂弧菌污染的海產(chǎn)品、肉、蔬菜而引起的食源性暴發(fā)時有發(fā)生，霍亂目前仍然是我國一類防控的腸道傳染病。
　　霍亂發(fā)生的早期，及時補(bǔ)液和敏感抗生素的應(yīng)用是治療霍亂非常有效而簡單的

2、方法。早期補(bǔ)液能夠快速補(bǔ)充丟失的體液，恢復(fù)循環(huán)血量;在疾病急性期根據(jù)抗生素藥敏試驗選用敏感藥物可以縮短腹瀉的持續(xù)時間和排菌期，降低疾病嚴(yán)重性和縮短霍亂的傳染期。然而，隨著抗生素在臨床的廣泛應(yīng)用，甚至是濫用，霍亂弧菌的耐藥情況越來越嚴(yán)重。有研究報道，霍亂弧菌對治療霍亂的幾種傳統(tǒng)抗生素（如四環(huán)素、氯霉素、青霉素、鏈霉素）已高度耐藥，不宜再用于臨床治療，這無疑給霍亂臨床合理用藥提出挑戰(zhàn)。因此，加強(qiáng)霍亂弧菌藥物敏感性的監(jiān)測，可以為霍亂的臨床針對

3、性用藥，減少耐藥菌株的產(chǎn)生，以及防控霍亂的暴發(fā)流行提供科學(xué)依據(jù)。
　　廣東省是中國最早有霍亂病例記載的省份之一，也是我國霍亂的流行高發(fā)地區(qū)。據(jù)歷史資料記載，早在1817年，霍亂便由印度經(jīng)曼谷傳入中國的香港、澳門、廣州等地，自此至1947年止的100多年間，在廣州、汕頭、北海、海南等沿海地區(qū)發(fā)生了近百次大小流行。1961年7月，引起第七次霍亂世界大流行的O1群E1 Tor型霍亂弧菌在廣東省陽江市首次暴發(fā)，成為我國O1群ElTor型霍

4、亂弧菌流行的起源地。至2013年止，廣東省霍亂累計發(fā)病79386例，死亡1942人。因此，研究廣東省霍亂弧菌的耐藥情況對我國的總體耐藥情況有參考和代表性意義。
　　本研究擬對廣東省1961-2013年50多年來從霍亂病例中分離的O1/O139群霍亂弧菌485株，其中O1群360株，O139群125株，進(jìn)行最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）抗生素敏感性試驗，以此了解我省O1/O1

5、39群霍亂弧菌的總體耐藥表型特征，并比較分析不同年代分離的O1/O139群霍亂弧菌之間的耐藥表型的差異;分析菌株的多重耐藥情況，并對多重耐藥嚴(yán)重的菌株進(jìn)行耐藥相關(guān)可移動遺傳元件(整合子和SXT)、耐藥基因PCR檢測和脈沖場凝膠電泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分子分型，以期深入分析這些多重耐藥菌株的分子特征和菌株間的遺傳關(guān)系，為進(jìn)一步分析我省O1/O139群霍亂弧菌多耐藥菌株產(chǎn)生的分子機(jī)理

6、，以及指導(dǎo)霍亂臨床合理用藥和防治提供實驗依據(jù)。
　　研究目的：
　　1.了解1961-2013年50余年來廣東省O1/O139群霍亂弧菌的總體耐藥表型特征，分析不同時期分離的霍亂弧菌的耐藥表型差異，為霍亂病例的臨床合理用藥提供實驗依據(jù);
　　2.分析菌株多重耐藥表型特征，并對多重耐藥菌株進(jìn)行耐藥相關(guān)可移動遺傳元件(整合子和SXT)和耐藥基因檢測，了解其分布特征，對多重耐藥菌株的耐藥機(jī)制進(jìn)行初步探討;
　　3.探討

7、多重耐藥菌株間的遺傳相關(guān)關(guān)系，為多重耐藥霍亂菌株的防控和溯源提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　研究方法：
　　1.菌株來源:實驗菌株為1961-2013年間廣東省疾控中心從全省各地市收集分離保存的O1/O139群霍亂病例菌株，來源于廣東省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗所菌種庫。
　　2.研究方法:應(yīng)用分層隨機(jī)抽樣方法抽取實驗菌株;微量肉湯稀釋法檢測菌株耐藥表型;多重PCR方法檢測整合子、SXT元件和相關(guān)耐藥基因;PFGE分型技術(shù)探討菌株

8、間的遺傳相關(guān)性。
　　研究結(jié)果：
　　1.360株O1群試驗菌株對頭孢曲松和頭孢吡肟100％敏感，對亞胺培南、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素、氯霉素、阿奇霉素、慶大霉素、萘啶酸、氨芐西林、阿莫西林和四環(huán)素等10種抗生素的耐藥率均在10％以下;菌株對頭孢西丁、甲氧芐氨嘧啶和磺胺甲惡唑的耐藥率上升，分別為13.3％，14.7％，24.4％;菌株對鏈霉素耐藥率最高，85.3％的菌株出現(xiàn)耐藥。不同時期分離菌株的耐藥特征分析顯示，1961-199

9、0年期間分離的菌株對萘啶酸、四環(huán)素、甲氧芐氨嘧啶和磺胺甲惡唑均未出現(xiàn)耐藥，然而從1991年開始，分離的菌株對這四種抗生素的耐藥率呈快速增加趨勢，特別是磺胺甲惡唑，90年代耐藥率已高達(dá)74.6％。鏈霉素的耐藥率在60年代開始即高達(dá)78.1％，此后一直保持高耐藥率，2001年以來耐藥率增加到94.6％。
　　2.125株O139群霍亂弧菌試驗菌株均為未見對頭孢曲松、頭孢吡肟、亞胺培南和環(huán)丙沙星耐藥;菌株對頭孢西丁、阿奇霉素、多西環(huán)素、

10、阿莫西林、慶大霉素的耐藥率在20％以下，分別為7.2％，12.0％，15.2％，19.2％，20.0％;菌株對氨芐西林、四環(huán)素和萘啶酸出現(xiàn)了一定程度耐藥，耐藥率分別為34.4％，35.2％和37.6％;然而，菌株對甲氧芐氨嘧啶、磺胺甲惡唑和鏈霉素耐藥最嚴(yán)重，耐藥率分別為67.2％，75.2％，89.6％。
　　3.O1群和O139群霍亂弧菌多重耐藥特征分析結(jié)果顯示，O1和O139群菌株多重耐藥率分別為25.9％，76.8％，O13

11、9群菌株的多耐率明顯高于O1群(p＜0.01)。O1群可分出36種不同耐藥譜，其中有2株同時對9種抗生素耐藥，耐藥譜為FOX+GEN+AMP+TMP+SMX+NAL+STR+AZI+AMX;O139群可分出46種不同耐藥譜，其中有6株同時對10種抗生素耐藥，耐藥譜為TET+GEN+AMP+CHL+TMP+SMX+NAL+STR+AZI+AMX。兩種血清群菌株不同流行期多耐率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，隨著時間變化，多耐率呈升高

12、趨勢。
　　4.耐藥基因檢測結(jié)果顯示，Ⅰ類整合子在O1和O139兩種血清群菌株中的陽性率分別為33.7％、22.9％;Ⅳ類整合子的陽性率分別為81.4％、71.9％。Ⅱ類和Ⅲ類整合子均未檢測到。57.0％的O1群和60.4％的O139群霍亂弧菌多重耐藥菌株攜帶SXT元件。dfrA1只特異地存在于O1群菌株中，而dfr18只特異地存在于O139群菌株中，分別介導(dǎo)甲氧芐啶嘧啶的耐藥;strA、strB（介導(dǎo)鏈霉素耐藥），sulⅡ（介導(dǎo)

13、磺胺甲惡唑耐藥）和floR（介導(dǎo)氯霉素耐藥）等四種耐藥基因均廣泛分布于O1群和O139群多重耐藥菌株中。
　　5.PFGE分型結(jié)果顯示，86株O1群耐藥菌株可分為65個型別，PFGE條帶相似度為66.0％-100％;96株O139群耐藥菌株可分為74個型別， PFGE指紋圖譜相似度為69.3％-100％。具有相同耐藥譜的多重耐藥菌株菌株P(guān)FGE指紋圖譜不完全一致，而具有相同PFGE圖譜的菌株其耐藥譜不完全一致，多耐嚴(yán)重（對9種以上

14、抗生素耐藥）具有相同耐藥譜的菌株，PFGE圖譜差異較大。可見PFGE圖譜與耐藥譜之間無明顯相關(guān)性，提示PFGE型別存在明顯遺傳多樣性，多耐藥的O1/O139群霍亂弧菌在我省廣泛存在。
　　研究結(jié)論：
　　1.廣東省O1/O139群霍亂弧菌對頭孢曲松、頭孢吡肟、亞胺培南、環(huán)丙沙星的敏感率較高，可作為在臨床上治療霍亂病人的首選藥物;此外O1/O139群霍亂弧菌對鏈霉素、甲氧芐氨嘧啶和磺胺甲惡唑耐藥嚴(yán)重。
　　2.廣東省霍亂

15、弧菌的多重耐藥率逐漸升高，在1990年之前，多耐率為8.8％，1990年后，多耐率高達(dá)58.6％;耐藥譜也隨著年代的推移在不斷變化和增寬，提示應(yīng)改善多耐藥菌株產(chǎn)生的環(huán)境和條件，繼續(xù)加強(qiáng)對霍亂弧菌耐藥抗生素和耐藥譜的監(jiān)測。
　　3.Ⅰ類、Ⅳ類整合子和SXT元件及其攜帶的耐藥基因在多重耐藥O1/O139群霍亂弧菌菌株中廣泛存在，提示菌株多重耐藥性可能與其獲得并攜帶了耐藥基因的有關(guān)，因此應(yīng)該注意加強(qiáng)多重耐藥菌株中耐藥基因的檢測和分析，密