霍亂弧菌zot基因的克隆表達及其對人小腸上皮細胞凋亡作用的研究.pdf

1、目的：
　　用 PCR方法檢測霍亂弧菌 ctxAB和zot毒力基因，研究兩毒力基因之間的共存關(guān)系，從霍亂弧菌（ Vibrio cholera） M045中克隆小帶聯(lián)結(jié)毒素(zonula occludens toxin，zot)的全基因序列，構(gòu)建其原核表達質(zhì)粒 pET-32a(+)-zot并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 E.coli BL21(DE3)中，通過誘導(dǎo)表達和親和層析純化重組蛋白，初步研究zot表達蛋白對人小腸上皮細胞的凋亡作用。

2、>　　方法：
　　1、用 PCR檢測方法檢測江西省2000~2012年分離的239株霍亂弧菌中ctxAB和zot毒力基因。
　　2、采用 PCR技術(shù)從霍亂弧菌 M045中抽提基因組 DNA中擴增出zot基因。
　　3、將zot基因克隆至原核表達質(zhì)粒pET-32a(+)中，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET-32a(+)-zot，雙酶切鑒定并DNA測序驗證。
　　4、將重組質(zhì)粒 pET-32a(+)-zot轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL

3、21(DE3)篩選表達菌株E.coli BL21(DE3)/ pET-32a(+)-zot，并用IPTG誘導(dǎo)其表達zot蛋白，利用SDS-PAGE分析蛋白產(chǎn)物。
　　5、利用親和層析柱（Ni-IDA Resin）純化表達蛋白，用Western blot對純化蛋白進行鑒定。
　　6、將純化的zot表達蛋白作用于已貼壁生長的人小腸上皮細胞后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1、41株 ctxAB毒力基因

4、檢測陽性的霍亂弧菌檢測zot基因為陰性，說明ctxAB和zot毒力基因之間不存在共存關(guān)系。
　　2、克隆出了全長約1200bp的霍亂弧菌zot基因編碼區(qū)，說明 PCR擴增zot全基因成功。
　　3、重組質(zhì)粒雙酶切及DNA測序結(jié)果顯示pET-32a(+)-zot構(gòu)建成功。
　　4、SDS-PAGE分析表達菌株總蛋白顯示在與目標蛋白大小一致的位置出現(xiàn)一條亮的條帶，說明zot蛋白表達成功。
　　5、利用親和層析柱（Ni

5、-IDA Resin）獲得純化的重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和凝膠成像系統(tǒng)分析，純化蛋白的分子量約為47kD，濃度為0.324mg/ml，經(jīng)Western blot驗證重組蛋白為目的蛋白。
　　6、用流式細胞儀檢測經(jīng)重組蛋白作用的人小腸上皮細胞顯示zot表達蛋白能引起人小腸上皮細胞的早期凋亡。
　　結(jié)論：
　　本論文成功地克隆了zot的全基因，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET-32a(+)-zot，成功構(gòu)建了重組菌株 E.co