半滑舌鰨生長軸關(guān)鍵基因的重組表達(dá)及對(duì)生長與生殖的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、本文以我國鲆鰈類主導(dǎo)養(yǎng)殖品種—半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis Günther)為研究對(duì)象,運(yùn)用分子克隆、原核表達(dá)和Western blotting等技術(shù)手段成功構(gòu)建了半滑舌鰨GH、IGF-I和IGF-II體外原核表達(dá)系統(tǒng),得到了純化的具有生物活性的體外重組蛋白;通過腹腔注射誘導(dǎo)的方法驗(yàn)證了外源重組牛GH蛋白和重組半滑舌鰨IGF-I蛋白對(duì)半滑舌鰨的促生長作用,從血清GH和IGF-I表達(dá)水平、消化酶活力等角度探討了這

2、種促生長作用的機(jī)制;最后,組合運(yùn)用組織切片、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和熒光實(shí)時(shí)定量PCR等方法研究了GH和IGF-I在半滑舌鰨生殖周期中的表達(dá)特性和可能的調(diào)控作用機(jī)制,為深入認(rèn)識(shí)半滑舌鰨生殖調(diào)控機(jī)制提供了理論支撐。本研究結(jié)果為全面揭示半滑舌鰨生長軸在生長和生殖中的調(diào)控作用提供了更為豐富的基礎(chǔ)資料相關(guān)結(jié)果如下:
　　1.半滑舌鰨GH、IGF-I和IGF-II的原核表達(dá)和活性分析
　　根據(jù)半滑舌鰨類胰島素生長因子-Ⅰ和Ⅱ的

3、cDNA全長序列,分析并設(shè)計(jì)引物克隆得到編碼IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ成熟肽序列,其成熟肽序列均由210個(gè)堿基組成,編碼70個(gè)氨基酸,包括B-C-A-D四個(gè)功能域。利用PCR方法將擴(kuò)增片段克隆到原核表達(dá)載體pET-28a上,得到重組質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌 BL21(DE3)后經(jīng) IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生 N端含6個(gè)組氨酸的融合蛋白。以SDS-PAGE電泳檢測和SigmaScan軟件分析獲得的蛋白,結(jié)果表明:IGF-Ⅰ融合蛋白大小為11.4K

4、D,在37℃條件下 IPTG誘導(dǎo)3h時(shí)目的蛋白表達(dá)量最高,占細(xì)菌總蛋白的58.5％,融合蛋白主要以包涵體形式存在。IGF-Ⅱ融合蛋白大小也為11.4KD,在IPTG誘導(dǎo)2h時(shí)目的蛋白表達(dá)量最高,占細(xì)菌總蛋白的43.7%。利用Western blotting方法驗(yàn)證這兩種融合蛋白均可特異性的被6×His抗體識(shí)別。誘導(dǎo)表達(dá)蛋白后的菌液沉淀經(jīng)6mol/L鹽酸胍變性、Ni2+離子親和柱純化和尿素梯度復(fù)性,獲得大小為11.4KD的純化蛋白。細(xì)胞增

5、殖實(shí)驗(yàn)表明,本研究所得IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ融合蛋白能顯著促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞MDA231細(xì)胞的增殖,具有明顯的生物學(xué)活性。
　　根據(jù)半滑舌鰨生長激素(GH)基因的cDNA全長序列,分析并設(shè)計(jì)引物克隆得到編碼 GH的成熟肽序列,此序列由552個(gè)堿基組成。利用PCR方法將擴(kuò)增片段克隆到原核表達(dá)載體pET-28a上,得到重組質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌 BL21(DE3)后經(jīng) IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生 N端含6個(gè)組氨酸的融合蛋白。SDS-PAG

6、E電泳檢測和SigmaScan軟件分析表明:GH融合蛋白大小為26KD,在IPTG誘導(dǎo)4h時(shí)目的蛋白表達(dá)量最高,占細(xì)菌總蛋白的41.5%,主要以包涵體形式存在。利用Western blotting方法驗(yàn)證GH融合蛋白可特異性的被6×His抗體識(shí)別。誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液沉淀經(jīng)純化和復(fù)性后,獲得大小為26KD的純化蛋白。純化后的GH融合蛋白稀釋后以ELISA方法測定分析,結(jié)果顯示本研究獲得的半滑舌鰨 GH融合蛋白具有抗原活性。細(xì)胞增殖試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)較

7、高濃度的重組半滑舌鰨 GH在體外具有抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA231細(xì)胞增殖的特性,表明其可能具有生物學(xué)活性。
　　2.重組GH和IGF-I對(duì)半滑舌鰨幼魚生長的影響及機(jī)制研究
　　利用注射誘導(dǎo)方法認(rèn)識(shí)了外源重組牛 GH和重組半滑舌鰨 IGF-I對(duì)半滑舌鰨幼魚生長的影響,并從血清生長相關(guān)激素水平和消化酶角度分析了其可能的機(jī)制。結(jié)果表明:10μg/尾的外源重組牛GH可促進(jìn)半滑舌鰨的生長,體重增重率比對(duì)照組高28.38%;2.5μg/

8、尾和25μg/尾的重組半滑舌鰨IGF-I可顯著促進(jìn)半滑舌鰨生長,體重增重率比對(duì)照組分別高35.75%和50.91%(P<0.05)?？焖偕L的試驗(yàn)魚餌料轉(zhuǎn)化效率升高,腸道蛋白酶和淀粉酶活力升高,但血清中GH和IGF-I表達(dá)水平變化不明顯。這些結(jié)果表明外源GH或IGF-I可促進(jìn)養(yǎng)殖半滑舌鰨的生長,其可能主要是通過提高試驗(yàn)魚的餌料轉(zhuǎn)化效率和消化酶活力實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果為深入認(rèn)識(shí)半滑舌鰨生長軸(GH/IGF-I axis)的調(diào)控作用機(jī)制和建立

9、實(shí)用的半滑舌鰨養(yǎng)殖生長調(diào)控技術(shù)提供了基礎(chǔ)資料。
　　3.半滑舌鰨GH與IGF-I對(duì)卵巢發(fā)育的調(diào)控作用及機(jī)制研究
　　利用組織切片技術(shù)將半滑舌鰨卵巢發(fā)育劃分為Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ5個(gè)時(shí)期,采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測在卵巢發(fā)育的不同時(shí)期半滑舌鰨垂體GH和腦、垂體、性腺、肝臟IGF-I基因mRNA的表達(dá)水平變化,并利用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法研究了半滑舌鰨血清中GH和IGF-I的表達(dá)水平變化。結(jié)果表明:隨卵巢的發(fā)育垂體

10、GH mRNA表達(dá)水平水平逐漸升高,在產(chǎn)卵期(Ⅴ期)達(dá)峰值(P<0.05),在產(chǎn)卵結(jié)束后迅速下降(P<0.05)。肝臟IGF-I mRNA表達(dá)水平自Ⅱ期開始緩慢下降并在Ⅳ期達(dá)到最低水平(P<0.05),在產(chǎn)卵期(V期)又開始緩慢升高,當(dāng)產(chǎn)卵結(jié)束后(Ⅵ期)迅速上升達(dá)到最高水平(P<0.05)。卵巢IGF-I mRNA表達(dá)水平自Ⅱ期開始顯著升高(P<0.05)并在Ⅳ期達(dá)峰值(P<0.05),在 V期明顯降低(P<0.05)并保持至產(chǎn)卵結(jié)束后

11、的Ⅵ期。垂體IGF-I mRNA表達(dá)水平在Ⅲ期明顯升高(P<0.05),但其后下降至Ⅱ期水平,但在產(chǎn)卵結(jié)束后的Ⅵ期迅速升高至較高水平(P<0.05)。腦中IGF-I mRNA表達(dá)水平自Ⅲ期開始顯著升高(P<0.05)并在V期時(shí)達(dá)峰值(P<0.05)。
　　卵巢發(fā)育至Ⅱ期和Ⅲ期時(shí)半滑舌鰨血清GH表達(dá)水平差異不顯著,在Ⅲ期時(shí)表達(dá)水平最低,但在產(chǎn)卵期(Ⅴ期)達(dá)到峰值,與其它各期差異顯著(P<0.05),其變化規(guī)律與垂體GH mRNA表達(dá)