東農(nóng)冬麥1號越冬期間的microRNA高通量測序及生物信息學(xué)分析.pdf

1、東農(nóng)冬麥1號作為黑龍江省唯一能安全過冬的栽培品種，有著重要抗寒miRNA和miRNA相關(guān)靶基因資源。
　　 本研究旨在挖掘東農(nóng)冬麥1號的優(yōu)良抗寒miRNA資源。一方面揭示“東農(nóng)冬麥1號”強抗寒機理，拓寬冬小麥抗寒遺傳基礎(chǔ)，為栽培冬小麥轉(zhuǎn)基因研究提供優(yōu)良抗寒miRNA靶基因源，從而最終為北方地區(qū)栽培冬小麥的改良做出重要貢獻；另一方面也為miRNA代謝機制的深入研究提供重要信息。
　　 本研究以東農(nóng)冬麥1號分為試驗材料，在大

2、田自然降溫條件下，分別于5℃、-15℃和-25℃三個不同低溫下取材分蘗節(jié)，采用HiSeq技術(shù)進行高通量測序，測序片段長度經(jīng)統(tǒng)計分析進行Rfam(10.1)、Genbank數(shù)據(jù)庫和重復(fù)序列篩選，最后把所有的得到的片段進行注釋分類，找到三個溫度點的所有miRNA，包括已知和未知miRNA.。對已知miRNA進行分析，首先進行堿基偏向性分析，構(gòu)建三個溫度時間點miRNA表達譜，然后進行miRNA差異分析，并構(gòu)建miRNA差異表達譜，然后對已知

3、的miRNA進行表達差異分析和家族分析；對未知的miRNA進行預(yù)測分析，包括堿基偏向性分析和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，未知miRNA的表達差異分析和靶基因預(yù)測，最后預(yù)測其未知miRNA的功能。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.小麥Small RNA測序數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析
　　 采用Solexa測序得到序列長度為10-35nt的小RNA片段，其中文庫中數(shù)量最多的小RNA是24nt和21nt，最終在5℃、-15℃、-25℃三個溫度條件下獲得

4、的潔凈reads總量分別是10024183、9448982和10868683。
　　 將reads片段與Rfam(10.1)和Genbank數(shù)據(jù)庫比對，去除其中可能的rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA和tRNA。剩下的reads片段通過重復(fù)序列比對去除不同類型的重復(fù)序列，最后經(jīng)sRNA分類注釋篩選，獲得三個不同溫度下篩選出的miRNA總數(shù)分別為1299843、1167152和1544325。
　　 2.在冷誘

5、導(dǎo)下小麥中已知miRNA鑒定及差異表達分析
　　 構(gòu)建小麥已知miRNA表達譜。在小麥miRBase中的已知miRNA有44個，在東農(nóng)冬麥1號三個樣品中(分別為5℃、-15℃、-25℃下取樣分蘗節(jié))分別發(fā)現(xiàn)有35、29和31個，分析小麥保守miRNA閱讀框的數(shù)量后，發(fā)現(xiàn)這些miRNA的表達頻率差異很大，其中11個miRNA出現(xiàn)的序列次數(shù)相對較高。在差異分析中發(fā)現(xiàn)5個與冷誘導(dǎo)有關(guān)的miRNA，分別是tae-miR156、tae-m

6、iR398、tae-miR160、tae-miR444和tae-miR444b。tae-miR156的表達豐度最高，有下調(diào)表達趨勢；tae-miR398明顯上調(diào)表達且差異顯著；tae-miR160顯著下調(diào)表達；tae-miR444和tae-miR444b皆為顯著下調(diào)表達。根據(jù)差異表達分析和已有報道的靶基因分析，本研究推測以上五個miRNA與東農(nóng)冬麥1號抗寒有關(guān)。
　　 3.東農(nóng)冬麥1號中的部分已知miRNA鑒定及差異表達分析

7、r>　　 東農(nóng)冬麥1號在冷誘導(dǎo)下發(fā)現(xiàn)了567個已知miRNA，其中發(fā)生顯著或極顯著差異表達的共164個，我們選擇其中的30個miRNA進行差異表達分析，在東農(nóng)冬麥1號中篩選獲得了4個差異表達的已知miRNA，其中3個與花發(fā)育有關(guān)，分別是Tae-miR168、Tae-miR166、Tae-miR172；5個與冷誘導(dǎo)有關(guān)，分別是Tae-miR393、Tae-miR169、Tae-miR397、Tae-miR319和Tae-miR165；6

8、個功能未知miRNA，但由冷誘導(dǎo)產(chǎn)生、豐度高，且差異顯著的已知的miRNA，分別是Tae-miR5565、Tae-miR5029、Tae-miR5070、Tae-miR5139、Tae-miR5218和Tae-miR3704。
　　 4.預(yù)測新的miRNA
　　 本研究在三個低溫時間點上共發(fā)掘出378個新的小麥miRNA，其中5℃下獲得124個，-15℃下獲得96個，-25℃下獲得125個。三個低溫點分別預(yù)測到的靶基因數(shù)

9、分別是89個、7個8和99個。在預(yù)測miRNA數(shù)據(jù)庫中挑選表達量大、均一化處理后表達差極顯著的miRNA，最終在東農(nóng)冬麥1號中篩選出了14個新miRNA。通過建立預(yù)測新miRNA表達譜，并利用Mireap軟件預(yù)測，發(fā)現(xiàn)這14個miRNA都具有代表性的二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)。對選擇的14個新miRNA進行靶基因預(yù)測，其中7個預(yù)測到了靶基因，另7個沒有預(yù)測到靶基因。本研究對感興趣的3個新miRNA進行了靶基因分析，初步預(yù)測了這3個新miRNA的功能是