動物醫(yī)學(xué)本科畢業(yè)論文

1、<p><b>　　河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院</b></p><p>　　論文題目： 鵝血清及卵黃中IgG的測定 </p><p>　　學(xué)生姓名： 王樂樂 </p><p>　　學(xué)號： 110580

2、 </p><p>　　專業(yè)年級： 高牧11-5 </p><p>　　2013年 4月 22日</p><p><b>　　目 錄</b></p><p>　　鵝血清及卵黃中IgG的測定</p><p>　　學(xué) 生：趙冬冬</p>&

3、lt;p>　　專 業(yè)：畜禽生產(chǎn)教育 2004級</p><p><b>　　指導(dǎo)教師：郎仲武</b></p><p>　　摘要：免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，簡稱IgG）指具有抗體活性的動物蛋白。在禽類，母代可以通過卵子將自身的免疫球蛋白傳遞給子代，對子代起到保護作用[20]。本試驗應(yīng)用ELISA對102枚吉林白鵝種蛋進行檢測，檢測項目為

4、鵝胚發(fā)育過程卵黃中IgG和鵝胚血清中IgG的含量。結(jié)果表明，鵝胚血清中和卵黃中IgG含量是，14.5日齡為0.1717μg/mL和3967.62μg/mL，34.5日齡（出殼3.5天）日齡為1495.6413μg/mL和2821.363μg/mL。</p><p>　　關(guān)鍵詞：鵝;免疫球蛋白G;ELISA</p><p><b>　　1 前 言</b></p

5、><p>　　卵黃抗體即卵黃免疫球蛋白就是卵黃中的γ—卵黃球蛋白，由于其蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)、免疫學(xué)性質(zhì)等方面與哺乳動物免疫球蛋白存在一定差異[1，2]，所以在免疫學(xué)領(lǐng)域把由禽卵黃中獲得的抗體稱為卵黃免疫球蛋白(Immunoglobulin of Yolk，簡稱IgY)[3]。IgY的用途是非常廣泛、多樣的，其中最重要的功能是由母體傳遞IgY給新生兒提供被動地免疫保護力。IgY普遍存在于鳥類、爬行動物和兩棲類，在功能

6、上等價于哺乳動物IgG，但其許多生物學(xué)性質(zhì)仍未被發(fā)現(xiàn)。</p><p>　　免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)是指免疫系統(tǒng)受抗原刺激后,B細胞轉(zhuǎn)化為漿細胞而產(chǎn)生的具有抗體活性,能與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白,或指化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白。它廣泛存在于機體的血清、體液及粘膜分泌液中,是構(gòu)成機體體液免疫的主要物質(zhì)，免疫球蛋白分為IgG、IgA、IgM、IgD和IgE[4，5]。禽類已確證的免疫球

7、蛋白有三種：即IgG（IgY）、IgM和IgA[6]。其中IgG是最主要的免疫球蛋白，約占動物血漿丙種球蛋白的70%，分子量約15萬，含糖2～3%。IgG具有提高免疫力、增強機體抵抗力等作用。目前國內(nèi)尚沒有定量檢測鵝IgG的相關(guān)報道。本文應(yīng)用酶聯(lián)接免疫吸附劑測定法(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，簡稱ELISA)對鵝血清及卵黃中的IgG含量進行了測定，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。</p><

8、;p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1 試驗材料</b></p><p>　　2.1.1 試驗動物</p><p>　　吉林白鵝種蛋購于吉林省某種鵝場</p><p>　　2.1.2 主要試劑</p><p>　　磷酸氫二鈉

9、 分析純 北京化工廠</p><p>　　磷酸二氫鈉 分析純 北京化工廠</p><p>　　牛白蛋白（生化試劑） 分析純 上海新興生物有限公司</p><p>　　氯化鈉 分析純 北京化工廠&l

10、t;/p><p>　　飽和硫酸氨Sephadex—G200 分析純 北京鼎國生物有限公司</p><p>　　辣根過氧化物酶 分析純 北京鼎國生物有限公司</p><p>　　鵝IgG、鼠抗鵝IgG抗體、兔抗鵝IgG酶標抗體為本實驗室自制</p><p>　　2.1.3 儀器與設(shè)備</

11、p><p>　　恒溫箱、電子天平；40孔聚苯乙烯酶標反應(yīng)板；XYJ80－1臺式離心機 ；LD4－2A低速離心機；北京醫(yī)用離心機廠；磁力攪拌器（78－1型磁力加熱攪拌器）分光光度計751C型；酶聯(lián)免疫檢測儀DG—3022型；孵化器；冰箱；酸度計pHS-3C ；ELISA板。</p><p><b>　　2.2 實驗方法</b></p><p>　　

12、2.2.1 鵝血清IgG的提取</p><p>　　取健康吉林白鵝的混合血清20mL，加生理鹽水20mL，再逐滴加入（NH4）2SO4飽和溶液10mL，使成為20％（NH4）2SO4溶液，充分混合后，靜置30min；3000rpm離心20min，棄沉淀；在上清液中再加（NH4）2SO4飽和溶液30 mL，使成50％（NH4）2SO4溶液，充分混合，靜置30 min；離心20 min，棄去上清；于沉淀中加入20

13、mL生理鹽水，使之溶解，再加（NH4）2SO4飽和溶液10 mL，使成33％（NH4）2SO4溶液，充分混合后，靜置30 min；3000 rpm離心20 min，棄去上清，以除去白蛋白，重復(fù)3次；用10mL生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋；透析除鹽，在常水中透析過夜，再在生理鹽水中于4℃透析24h，中間換液數(shù)次，直至完全除去SO42﹣或NH4﹢離心去沉淀；離心去沉淀（去除雜質(zhì)蛋白）上清液即為粗提的IgG；將G200凝膠活化、浮選、裝柱，以

14、0.01mol∕L pH 7.4 PBS液洗脫、平衡。并向其中加入上一步中所提取的粗提的IgG樣本，以PBS液洗脫，收集第二蛋白洗脫峰，濃縮即為精提IgG。</p><p>　　2.2.2 鵝血清及卵黃參考陰性與參考陽性的選擇及制備</p><p>　　2.2.2.1 鵝血清參考陰性的制備</p><p>　　取吉林白鵝血清5份充分混合（4ml/份），取此混合液

15、20mL，加生理鹽水20mL，充分混合，逐滴加入35％飽和硫酸銨，邊加邊攪拌，混合均勻后靜置30分鐘，然后3000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，棄去沉淀，上清裝入透析袋，常水流水透析12小時，然后生理鹽水透析24小時，其間換液數(shù)次。最后將提取液濃縮至原體積，重復(fù)3次。分裝凍存于－20℃冰箱。</p><p>　　2.2.2.2 鵝血清參考陽性的制備</p><p>　　取吉林白鵝血清5分，混合（

16、該血清取自制備參考陰性血清的吉林白鵝），分裝凍存于－20℃冰箱。</p><p>　　2.2.2.3 鵝卵黃參考陰性的制備</p><p>　　無菌取卵黃5份，充分混合，取此混合液20mL，蒸餾水10倍稀釋，用稀酸調(diào)節(jié)至PH5.2，8 000轉(zhuǎn)/分鐘離心。蒸餾水稀釋沉淀至卵黃原體積，將卵黃、生理鹽水、氯仿按1:2:2混合，混勻后置室溫2h，2 000克離心力離心20min，分成三相，油相

17、、水相、固相，棄去水相，然后將油相與固相充分混合，室溫下?lián)]發(fā)掉氯仿，蒸餾水稀釋至原體積。蒸餾水稀釋7倍，分裝凍存與-20℃冰箱中[8]。</p><p>　　2.2.2.4 鵝卵黃參考陽性的制備</p><p>　　無菌取卵黃5份，充分混合，蒸餾水7倍稀釋（該卵黃取自制備參考陰性卵黃的種蛋），分裝凍存于－20℃冰箱中。</p><p>　　2.2.3 雙抗體夾心

18、ELISA試驗各反應(yīng)條件的確定</p><p>　　2.2.3.1 包被抗體工作濃度確定 </p><p>　　用0.01mol/L pH9.5的碳酸鹽緩沖液將小鼠抗鵝IgG稀釋成5µg/mL、10µg/mL、20µg/mL、30µg/mL、40µg/mL、50µg/mL、60µg/mL、70µg/mL、80

19、µg/mL分別包被酶標反應(yīng)板，對鵝血清100倍稀釋進行ELISA檢測。</p><p>　　2.2.3.2 被檢鵝血清的最佳稀釋倍數(shù)的確定 </p><p>　　按包被抗原的工作濃度將抗原稀釋，包被酶標板，然后將混合鵝血清，分別用0.1％牛血清白蛋白的PBST液作40、50、60、70、80、90、100、200、400倍稀釋，每個稀釋度加五孔，進行ELISA檢測并計算出每個稀

20、釋度的平均OD值（490nm）。選擇OD值最接近于1時被檢鵝血清的稀釋倍數(shù)作為被檢鵝血清的最佳稀釋倍數(shù)。</p><p>　　2.2.3.3 待檢鵝卵黃最佳稀釋倍數(shù)的確定 </p><p>　　按包被抗原的工作濃度將抗原稀釋，包被酶標板，然后將混合鵝卵黃，分別用0.1％牛血清白蛋白的PBST液作4、8、10、16、20、32、64、100倍稀釋，每個稀釋度加五孔，進行ELISA檢測并

21、計算出每個稀釋度的平均OD值（490nm）。選擇OD值最接近于1時被檢鵝卵黃的稀釋倍數(shù)作為被檢鵝血清的最佳稀釋倍數(shù)。</p><p>　　2.2.3.4 按包被抗原的工作濃度</p><p>　　將抗原稀釋，包被酶標板，然后分別將五份卵黃混合，分別用0.1％牛血清白蛋白的PBST液作1、2、4、8、10、16、20、32、64、100倍稀釋，每個稀釋度加五孔，進行ELISA檢測并計算出每

22、個稀釋度的平均OD值（490nm）。選擇OD值最接近于1時被檢鵝卵黃的稀釋倍數(shù)作為被檢卵黃的最佳稀釋倍數(shù)。</p><p>　　2.2.3.5 最適抗原包被時間的確定 </p><p>　　分別將小鼠抗鵝IgG包被后于37℃ 3h、4℃過夜、37℃ 3h后4℃過夜，進行測定，觀察結(jié)果。</p><p>　　2.2.3.6 最適抗原抗體反應(yīng)時間的確定 </p

23、><p>　　將抗原抗體分別作用37℃ 60min、90 min、120min，進行測定。</p><p>　　2.2.3.7 最適酶標抗體作用時間的確定 </p><p>　　酶標抗體作用時間分別為37℃ 60min、90 min、120min，進行測定。</p><p>　　2.2.3.8 最適底物作用時間的確定 </p>

24、<p>　　底物反應(yīng)時間分別為37℃15min、30min、45min，進行測定，觀察結(jié)果。</p><p>　　2.2.4 陽性判定值的確定</p><p>　　ELISA檢測方法在結(jié)果判斷上是定性測定，對受檢標本分別用“陽性”、“陰性”表示。根據(jù)國家流行病學(xué)調(diào)查要求，陽性O(shè)D值應(yīng)為陰性4倍。</p><p>　　2.2.5 ELISA檢測方法的檢驗

25、</p><p>　　2.2.5.1 敏感性試驗 </p><p>　　將5份成年鵝血清的混合液以0.1％牛血清白蛋白的PBST液作50、60、70、80、90、100、200、400倍稀釋，按照已建立的ELISA進行檢測，測定OD值，確定鵝血清的敏感反應(yīng)滴度。</p><p>　　2.2.5.2 重復(fù)性試驗</p><p>　　選取數(shù)

26、份鵝血清及鵝卵黃，按建立的ELISA進行五次檢測，測定其OD值變化，觀察結(jié)果。</p><p>　　2.2.5.3 特異性試驗</p><p>　　以小鼠抗鵝血清包被反應(yīng)板，成年鵝血清20份，與未用鵝IgG免疫的小鼠血清包被反應(yīng)板對比，檢測其OD值。</p><p><b>　　3 結(jié)果</b></p><p>　　

27、3.1 鵝IgG及其抗體制備結(jié)果</p><p>　　鵝IgG經(jīng)飽和硫酸銨法粗提后，進行Sephadex-G200層析，所獲得的收集液體，用751分光光度計計算蛋白含量，根據(jù)所得的OD值（280nm）繪制曲線如下圖所示：</p><p>　　圖1 Sephodex-G200純化鵝IgG</p><p>　　Fig 1. Purification of goose’

28、s IgG with SephodexG200</p><p>　　經(jīng)Sephadex－G200純化鵝IgG所獲得的曲線圖可知，第一峰和第二峰出現(xiàn)的間隔很小，所以在收集洗脫液時，只從第二峰左側(cè)收集蛋白OD值大于0.25的洗脫液至第二峰右側(cè)OD值大于0.2的洗脫液。然后將此收集液濃縮，并計算蛋白含量[9，10]。</p><p>　　用751分光光度計測得OD280和OD260值并按下式計算

29、蛋白濃度，蛋白濃度(mg/mL)=(OD280×1.45-OD260×0.74) ×稀釋倍數(shù)。計算鵝IgG蛋白蛋白含量為10.7318mg/mL。</p><p>　　3.2 雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立</p><p>　　3.2.1 被檢鵝血清參考陽性與鵝卵黃參考陰性的最佳稀釋倍數(shù)的確定</p><p>　　表 4 被檢血

30、清的最佳稀釋倍數(shù)的確定</p><p>　　Table 4 Determination of serum dilution</p><p>　　由以上表可知，將血清100倍稀釋時，其OD值最接近1.0，參考陰性為0.19，符合P/N＞4，因此，在檢測時將血清100倍稀釋。</p><p>　　3.2.2 被檢鵝卵黃參考陽性與鵝卵黃參考陰性的最佳稀釋倍數(shù)的確定<

31、;/p><p>　　表 5 被檢卵黃的最佳稀釋倍數(shù)的確定</p><p>　　Table 5 Determination of yolk dilution</p><p>　　由以上表可知，將卵黃進行20倍稀釋時，其OD值最接近1.0，參考陰性為0.21，符合 P/N ＞4， 因此，在檢測時將卵黃20倍稀釋。</p><p>　　3.2.3 最

32、適底物作用時間的確定</p><p>　　表 6 最適底物作用時間</p><p>　　Table 6 Results of various incubated time of substrate</p><p>　　底物反應(yīng)時間分別為37 ℃15 min、30 min、45 min，進行測定后，試驗結(jié)果表明，當?shù)孜锏淖饔脮r間30 min時，初乳的OD值為1。因此將

33、底物作用時間確定為30 min。</p><p>　　3.2.4 IgG敏感性試驗結(jié)果</p><p>　　在血清中，當已知含量的鵝IgG稀釋至0.0683594 μg/mL時，OD值不再有變化。</p><p>　　表7 血清敏感性試驗結(jié)果</p><p>　　Table 7 Results of sensitivity experime

34、nt for serum</p><p>　　在血清中，當已知含量的鵝IgG稀釋至0.0341767μg/mL時，OD值不再有變化，即該檢測方法檢測的靈敏度為0.0341767μg/mL。</p><p>　　表8 卵黃敏感性試驗結(jié)果</p><p>　　Table 8 Results of sensitivity experiment for egg yolk&l

35、t;/p><p>　　在卵黃中，當已知含量的卵黃稀釋至5μg/mL時，OD值不再有變化，即該方法的靈敏性為5μg/mL。</p><p>　　3.2.5 重復(fù)性試驗結(jié)果</p><p>　　取參照IgG進行ELISA檢測，3次不同時間的結(jié)果基本一致，說明本研究建立的雙抗體夾心ELISA方法具有相對較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。</p><p>　　3.

36、2.6 包被特異性試驗結(jié)果</p><p>　　將正常小鼠血清1:100倍稀釋，免疫過鵝IgG的小鼠血清按1:100倍稀釋，進行比較，結(jié)果表明正常小鼠血清與免疫的小鼠血清OD值差異顯著。</p><p>　　表9 包被抗體特異性實驗結(jié)果</p><p>　　Table 9 results of coating antibody specificity test&l

37、t;/p><p>　　3.3 蛋白標準含量曲線檢測結(jié)果</p><p>　　3.3.1 雙抗體夾心ELISA OD值與卵黃IgG含量的標準曲線</p><p>　　雙抗體夾心ELISA OD值與卵黃IgG含量通過做圖看出它們之間成冪函數(shù)關(guān)系，故求得回歸方程為y＝145.42ln(x)＋214.77</p><p>　　表10 雙抗體夾心ELI

38、SA OD值與鵝卵黃IgG含量</p><p>　　Table10 double antibody sandwich ELISA OD and content of IgG in egg yolk</p><p>　　圖2雙抗體夾心ELISA OD值與鵝卵黃IgG含量</p><p>　　Fig.2 double antibody sandwich ELISA OD

39、 and content of IgG in egg yolk</p><p>　　3.3.2 雙抗體夾心ELISA OD值與血清IgG含量的標準曲線</p><p>　　雙抗體夾心ELISA OD值與血清IgG含量通過做圖看出它們之間成冪函數(shù)關(guān)系，故求得回歸方程為y=23.865x5.6726</p><p>　　表11 雙抗體夾心ELISA OD值與血清IgG

40、含量</p><p>　　Table11 double antibody sandwich ELISA OD and content of IgG in serum</p><p>　　圖3雙抗體夾心ELISA OD值與IgG含量</p><p>　　Fig.3 double antibody sandwich ELISA OD and content of IgG

41、</p><p>　　3.4 鵝血清中IgG含量與鵝卵黃中IgG含量變化的比較</p><p>　　表14 14.5天和34.5天鵝胚血清中IgG含量與鵝卵黃IgG含量的比較</p><p>　　Table14 Comparison of IgG in serum and egg yolk（有錯誤）</p><p><b>　　圖

42、4</b></p><p>　　由圖4可見，鵝胚血清中IgG抗體從14.5日齡0.1717μg/mL升高到34.5日齡（出殼3.5天）1495.6413μg/mL，差異顯著（P＜0.05）；鵝卵黃中IgG抗體從14.5日齡3967.62μg/mL到34.5日齡(出殼后3d)降至2821.363μg/mL,差異顯著(P＜0.05)。整個階段鵝血清中IgG抗體含量總體呈現(xiàn)上升的趨勢；而鵝卵黃IgG抗體含量

43、總體呈現(xiàn)下降的趨勢；但是血清中抗體含量濃度的最高值(1495.6413μg/mL)也未超過卵黃抗體濃度的最低值(2821.363μg/mL),卵黃中抗體濃度遠高于血清中抗體濃度。</p><p><b>　　4 討 論</b></p><p>　　4.1 雙抗體夾心ELISA法</p><p>　　近二十幾年來，免疫學(xué)分析方法發(fā)展很快，特

44、別是在使用標記了的抗原和抗體的分析技術(shù)以后，使原來許多經(jīng)典的分析方法在敏感性和特異性方面都不能相比。繼50年代的免疫熒光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技術(shù)之后，1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標抗體技術(shù)發(fā)展成液體標本中微量物質(zhì)的測定方法，建立了用酶來

45、標記抗原或抗體的分析技術(shù)。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)，是一種用酶標記抗原或抗體的方法。由于酶的高效生物催化作用，一個酶分子在數(shù)分鐘內(nèi)可以催化幾十幾百個底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生了放大作用，使得原來極其微乎其微的抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識別出來。</p><p>　　ELISA試驗是一種敏感性高，特異性強，重復(fù)性好的實驗診斷方法。將抗原、抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用原理有機地結(jié)

46、合起來，可敏感地檢測體液中微量的特異性抗體或抗原。此項技術(shù)自70年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，由于其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡便，結(jié)果判斷較客觀等因素，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。4.2 鵝血清抗體及卵黃抗體變化</p><p>　　在卵黃抗體與血清抗體的比較結(jié)果中，可以發(fā)現(xiàn)卵黃抗體與血清抗體的消長規(guī)律在濃度上并不對應(yīng)。似乎卵黃抗體濃度并未減少，而且血清中抗體含量濃度的最高值也未超過卵黃抗體濃度

47、的最低值，但是總體上趨于上升的趨勢。這一現(xiàn)象試驗者有如下解釋：第一，雖然卵黃抗體的濃度變化不大，但是卵黃抗體的體積卻發(fā)生了很大的變化，在14.5日齡以后變化較明顯，而在34.5日齡以后卵黃抗體的體積為0，據(jù)此，雖然卵黃抗體的含量無明顯變化，但是，由于體積的改變，卵黃抗體（總量上）也在被動的向鵝胚血清轉(zhuǎn)移；第二，試驗者認為卵黃抗體在整個孵化過程中，除了被動轉(zhuǎn)移給鵝胚血清外，還有其他功能，如提供能量、提供形成組織的原料等，因此，鵝胚血清中的

48、抗體在總量上也少于卵黃中的抗體總量，也成了血清中抗體濃度小于卵黃中抗體濃度的可能原因之一。</p><p><b>　　5 結(jié) 論</b></p><p>　　5.1 鵝血清中和鵝卵黃中IgG含量</p><p>　　鵝胚血清中IgG抗體從14.5日齡0.1717μg/mL升高到34.5日齡（出殼3.5天）1495.6413μg/mL，差

49、異顯著（P＜0.05）；鵝卵黃中IgG抗體從14.5日齡3967.62μg/mL到34.5日齡(出殼后3d)降至2821.363μg/mL,差異顯著(P＜0.05)。目前在國內(nèi)尚未見到有關(guān)測定鵝IgG含量的相關(guān)報道。</p><p>　　5.2 鵝血清中和鵝卵黃中IgG含量變化趨勢</p><p>　　從14.5日齡和34.5日齡（出殼3.5天）檢測結(jié)果可知：鵝胚血清中IgG抗體含量總體

50、呈現(xiàn)上升的趨勢（0.1717μg/mL－1495.6413μg/mL）；而鵝卵黃IgG抗體含量總體呈現(xiàn)下降的趨勢(3967.62μg/mL－2821.363μg/mL)；但是血清中抗體含量濃度的最高值(1495.6413μg/mL)也未超過卵黃抗體濃度的最低值(2821.363μg/mL),可見，卵黃中抗體濃度遠高于血清中抗體濃度。</p><p><b>　　參 考 文 獻</b><

51、/p><p>　　陳雪嵐,許楊,熊勇華.中國大耳白兔與羅曼母雞對赭曲霉素A抗原免疫應(yīng)答性的研究[J].衛(wèi)生研究,2003,1.</p><p>　　[2] Jensenius J C,Andersen I,Hau J,et a1．Eggs：conveniently pack—aged antibodies．Mehtods for purification of yolk IgG[J]．J Im

52、—munol methods,1981,46(1)：63～68</p><p>　　[3]ROSE,M.E.ORLANS,E.Immunoglobulinsintheegg,embryoandyoungchick.[J]Developmental and Comparative Immunology,1981,5(1)：15～20</p><p>　　[4] 孫建宏,劉寶全. 雞免疫球蛋白

53、檢測技術(shù)的發(fā)展[J] . 黑龍江畜牧2000(10) :26-27</p><p>　　[5] Lundqvist ML ,Middleton D L ,Hazard S , et al. The ImmunoglobulinHeavy Chain Locus of the Duck :“GENOMIC ORGANIZATION ANDEXPRESSION OF D , J , AND CREGION GENES

54、”[J] . J Biol ,Chem. ,2001 ,276(50) :46729-46736</p><p>　　[6] 廖明,丘鶴英. 家禽免疫學(xué)基礎(chǔ)知識(J ) . 中國獸醫(yī)雜志,1996 ,</p><p>　　[7] 李決,朱寬佑,包文奇，等.抗雞新城疫病毒高免卵黃IgG的研制與應(yīng)用[J].鄭州牧專報,1990,10（1）：1～3</p><p>　　[

55、8]楊玉榮,鄭世民.卵黃免疫球蛋白的分離提取與鑒定[J].食品科技,2003,（5）：99～101</p><p>　　[9]Svendsen L,Crowley A,Ostergaard L H,et a1．Development and Comparison of purification strategies for chicken antibodies from egg yolk [J]．Lab Anim

56、 Sci．1995,45(1)：89～93</p><p>　　[10]社念興.獸醫(yī)免疫學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,1997,50</p><p>　　[11]何昭陽,胡貴學(xué),王春鳳.動物免疫學(xué)實驗技術(shù)[M].吉林科學(xué)技術(shù)出版社,2002</p><p>　　[12]Polson A,Coetzer T,Kruger J,et al. Improvements

57、in the isolation IgY from the yolks of eggs Jaid immunized hens[J].immunol invest,1985,14：323～327</p><p>　　[13]顧有方,劉艷慧,陳會良等.免疫球蛋白分離提取方法及其應(yīng)用的研究進展[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2004,12：12～14</p><p>　　[14]Higgins D

58、A,Cromie R L.Purijication of duck immunoglobulins：an evaluation of protein A and protein G affinity chromatography[J].Vet Immuno Immunopath,1995,44：169～180</p><p>　　[15]Ken T,Hirom I．Specific chicken egg ant

59、ibody and method for its production．European Patent Aplication,EP 050329l A1</p><p>　　[16]Polson A,von Wechmar MB,Fazakerley G.Antibody to proteins from yolk of immunized hens[J].Immunological communications

60、,1980,9(5)：495～514</p><p>　　[17]俞用川，李伊東，張勇力.ELISA雙抗體夾心改良法檢測小鼠抗天花粉特異性IgG.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報[J].1984.6（5）：35122(2) :55～56</p><p><b>　　致 謝</b></p><p>　　本論文是在導(dǎo)師郎仲武副教授和徐青元研究生的悉心指導(dǎo)下完成的