水稻細(xì)菌性條斑病菌中受DSF群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的外泌蛋白的功能研究.pdf

1、小分子DSF（DiffusibleSignalFactor）介導(dǎo)的群體感應(yīng)(Quorumsensing，QS)系統(tǒng)在黃單胞菌的侵染和致病過程中具有關(guān)鍵作用，但DSF調(diào)控的外泌蛋白的種類和功能仍不清楚。由稻黃單胞菌稻生致病變種（Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，Xoc）引起的水稻細(xì)菌性條斑病是我國(guó)水稻生產(chǎn)上一種重要的細(xì)菌病害。本研究以Xoc為對(duì)象，研究受DSF調(diào)控的外泌蛋白的種類、致病功能及機(jī)制，研究結(jié)果如下:<

2、br>　?。ㄒ唬┍緦?shí)驗(yàn)室趙延存博士的前期研究中鑒定了Xoc中受DSF調(diào)控的53個(gè)外泌蛋白（趙延存論文，2011）。本研究選取了其中15個(gè)感興趣的目標(biāo)蛋白用于后續(xù)研究。這15個(gè)蛋白的功能涉及小分子蛋白介導(dǎo)的群體感應(yīng)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞進(jìn)程、氧化壓力環(huán)境的適應(yīng)、中間代謝、蛋白降解以及功能未知的蛋白。采用基因定向缺失技術(shù)，對(duì)這15個(gè)蛋白的編碼基因進(jìn)行敲除，獲得相應(yīng)的基因缺失突變株。致病性測(cè)定顯示其中4個(gè)突變株顯著削弱了Xoc對(duì)寄主水稻的致病性，其

3、對(duì)應(yīng)的蛋白/基因分別是XOC_0319（Ax21同系物，依賴XA21的水稻免疫激發(fā)子）、XOC_2128（多聚半乳糖醛酸酶）、XOC_3806（蛋白酶）和XOC_1601（半胱氨酸蛋白酶）。表型分析表明，這4個(gè)基因?qū)oc的定殖能力、胞外多糖產(chǎn)量、游動(dòng)性、生物膜的形成、胞外蛋白酶活性、抗氧化壓力等毒力相關(guān)表型造成了不同程度的影響。具體結(jié)果如下:這4個(gè)基因的突變沒有影響Xoc的生長(zhǎng)速率，但影響了Xoc在水稻中接種發(fā)病后的定殖量，同時(shí)還均降

4、低了胞外多糖的產(chǎn)量。XOC_2128和XOC_1601的突變減弱了菌體游動(dòng)性，XOC_0319的突變減弱了生物膜的形成，XOC3806和XOC_1601的突變減弱了胞外蛋白酶活性，XOC3806和XOC_2128的突變使Xoc的抗氧化壓力能力有所增強(qiáng)。熒光定量顯示這四個(gè)基因在Rs105ΔrpfF的表達(dá)水平在一定程度上取決于培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)狀況，相關(guān)結(jié)果和Rs105ΔrpfF中差異蛋白表達(dá)情況不完全一致;同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)這四個(gè)基因?qū)?0個(gè)已知的

5、致病相關(guān)基因存在一定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。xpsE是Ⅱ型分泌系統(tǒng)關(guān)鍵基因，熒光定量PCR還顯示Rs105ΔrpfF中xpsE的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平顯著下降，說明DSF群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)Ⅱ型分泌系統(tǒng)的功能存在某種程度的調(diào)控作用。此外，Ax21（水稻XA21先天免疫激發(fā)子）是Xoo泌出的能在依賴XA21的水稻上激發(fā)先天免疫的硫化蛋白，并且Ax21還被認(rèn)為是Xoo中一種新型群體感應(yīng)的信號(hào)分子;XOC_0319就是Ax21在Xoc的同系物，本研究說明這兩種QS系

6、統(tǒng)的功能很可能存在交叉和聯(lián)系。本研究是黃單胞菌中第一次對(duì)受DSF介導(dǎo)的群體感應(yīng)調(diào)控的外泌蛋白及其功能進(jìn)行了系統(tǒng)深入分析，相關(guān)結(jié)果顯示了DSF型群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)Ⅱ分泌系統(tǒng)毒力因子及AX21介導(dǎo)的群體感應(yīng)有重要的調(diào)控作用，進(jìn)一步明確了Xoc中DSF型群體感應(yīng)系統(tǒng)的功能。
　?。ǘ┎≡诩闹鞅砻娴酿じ叫允瞧涑晒η秩镜南葲Q條件，主要在細(xì)菌黏附、定殖等侵染早期進(jìn)程中起重要作用，而這個(gè)過程是由被稱為黏性因子的蛋白質(zhì)來完成的。因此我們選擇了T

7、5SS泌出的兩個(gè)非菌毛黏性蛋白XadA、YapH進(jìn)行研究，對(duì)相關(guān)基因xadA、yapH進(jìn)行了缺失敲除，并對(duì)它們的致病機(jī)制及其與DSF型群體感應(yīng)系統(tǒng)的關(guān)系進(jìn)行了試驗(yàn)和分析。XadA和YapH是通過Ⅴ型分泌系統(tǒng)泌出的兩個(gè)黏性蛋白。我們找到了xadA、yapH的同系物，即XOC3808、XOC_2467，然后構(gòu)建了缺失突變體ΔxadA、yapH。致病相關(guān)表型的測(cè)定的結(jié)果顯示這兩個(gè)黏性蛋白均和Xoc的噴霧接種時(shí)的致病性、水稻葉片表面黏附性、胞外

8、多糖合成能力相關(guān)，但與非生物表面的黏附性無關(guān)。實(shí)時(shí)定量熒光PCR表明，xadA、yapH的在模擬植物汁液的培養(yǎng)條件下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的變化存在差異，其中yapH能夠被這種培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá);xadA、yapH的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受DSF型群體感應(yīng)通路調(diào)控的模式不同，其中yapH受rpfF、clp正向調(diào)控，xadA受rpfF、clp負(fù)向調(diào)控，說明DSF群體感應(yīng)系統(tǒng)很可能與外泌黏性蛋白功能的發(fā)揮密切相關(guān)。本研究首次為XadA、YapH在Xoc致病過程中的作