藥學(xué)專業(yè)畢業(yè)論文外文翻譯--5-fu修飾的白蘞素衍生物的合成與生物活性評價

1、<p><b>　　中文3629字</b></p><p>　　本科畢業(yè)論文(設(shè)計)外文翻譯</p><p><b>　　譯文：</b></p><p>　　5-FU修飾的白蘞素衍生物的合成與生物活性評價</p><p>　　Synthesis and Biological Evaluat

2、ion of New 5-Fluorouracil-Substituted Ampelopsin Derivatives</p><p>　　Wei-Ming Zhou 1,2,?, Rong-Rong He 1,?, Jian-Tao Ye 1, Na Zhang 1 and De-Yu Liu 1,*</p><p>　　摘 要：本文報道了兩種新型氟尿嘧啶取代的白蘞素衍生物。兩種新化合

3、物的結(jié)構(gòu)經(jīng)過1H-NMR，13C-NMR，IR和MS元素分析方法得到確證。用MTT法檢測這兩個化合物對K562和K562/ADR癌細(xì)胞株的體外抗癌活性，結(jié)果顯示這兩種新的化合物比參照藥物如白蘞素和維拉帕米更加有效。</p><p>　　關(guān)鍵詞：白蘞素，5-氟尿嘧啶，抗癌活性</p><p><b>　　1. 前言</b></p><p>　　白

4、蘞素（3, 5, 7, 3', 4', 5'–六羥基-2, 3 -二氫黃酮醇，CAS號：27200-12-0，1）是一種從中國傳統(tǒng)中藥粵蛇葡萄或藤茶的莖葉或根部提取出來經(jīng)過純化而得到的天然成分[1]。它也被稱為白蘞素或雙氫楊梅苷。在傳統(tǒng)的中醫(yī)學(xué)中，白蘞素具有消炎解毒的功能。我們的前期研究結(jié)果證明了白蘞素具有強(qiáng)大的抗腫瘤和抗氧化活性[2-3]。它可以通過抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和 bFGF的表達(dá)[4]而使得

5、癌細(xì)胞凋亡和腫瘤血管成長抑制。然而，白蘞素的化學(xué)結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定。其水溶液或有機(jī)溶液，在光照下容易分解，形成有色光解物[5]。一些研究通過修飾其化學(xué)結(jié)構(gòu)來提高白蘞素的穩(wěn)定性[6–8]。因此，可以通過另一種抗癌物質(zhì)與白蘞素的結(jié)合來改變了它的化學(xué)結(jié)構(gòu)從而提高了穩(wěn)定性。這種結(jié)合為惡性腫瘤的有效對癥化療提供了新的可能。</p><p>　　5-氟尿嘧啶（5-Fu，CAS:51-21-8）（2）首次合成的時間是在1957年[1

6、4]，是一種很好的癌癥治療藥物，尤其是消化道腫瘤[9–13]。它是一種治療惡性腫瘤的常用藥物，如乳腺癌，結(jié)腸癌和胃癌[15]。然而，由于嚴(yán)重的毒副作用，其臨床應(yīng)用受到了一定限制[16]。目前為減少其毒副作用而采取的修飾方法包括與小分子化合物結(jié)[17]，與其他化合物結(jié)合[18]，利用聚合物修飾[19]和結(jié)合聚合側(cè)鏈[20]。這些在N-1和/或者N-3上取代得到的衍生物已經(jīng)在藥效和藥代動力學(xué)特性方面得到了改善，其中提高了生物活性，選擇性提高

7、，代謝穩(wěn)定性和吸收能力，降低了毒性[21]。</p><p><b>　　圖1.反應(yīng)物結(jié)構(gòu)式</b></p><p>　　在此，我們通過加入氯乙酸連接兩個藥物分子得到了兩個新的5-氟尿嘧啶衍生物(3)（如方法1），選用四氫呋喃（THF）為溶劑，N’N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）作為縮合劑[22]。所得衍生物結(jié)構(gòu)經(jīng)1H-NMR，13C-NMR，IR和MS得到確證。此外，

8、這些新化合物的體外抗癌活性通過MTT法測定評估，選用K562癌細(xì)胞株，其逆轉(zhuǎn)耐藥性方面的測試選取K562/ADR細(xì)胞株。</p><p><b>　　2 結(jié)果與討論</b></p><p>　　2.1 合成和后處理</p><p>　　合成5-氟尿嘧啶-1-乙酸(4)：5-FU和氫氧化鉀混合液中，加入氯乙酸，在70℃下回流2小時，冷卻到室溫，用

9、濃鹽酸調(diào)PH至5.5。之后在4℃冷卻2h，過濾[23]得到的晶體為未反應(yīng)的5-FU。在這種情況下，反應(yīng)產(chǎn)物以陰離子狀態(tài)存在于溶液中。用濃鹽酸調(diào)PH至2，在4℃下冷卻6h，經(jīng)過這種處理方法可保證結(jié)晶完全，提高5-氟尿嘧啶-1-乙酸的產(chǎn)量。</p><p>　　圖2.方法1.化合物5,6的合成路線</p><p>　　為優(yōu)化5-FU和白蘞素酯縮合的最佳反應(yīng)條件我們考察了不同的催化劑，溶劑，反應(yīng)

10、時間和原料量的比這四個條件。實驗結(jié)果顯示傳統(tǒng)催化劑包括4 -二甲氨基吡啶（DMAP）和吡啶對產(chǎn)物5的產(chǎn)量沒有影響。在考察的三種溶劑中，丙酮和THF的溶解度比乙酸乙酯好。因丙酮在中國屬于管制品，所以選用THF作溶劑。結(jié)果還顯示產(chǎn)物5的產(chǎn)量在反應(yīng)6h時最大，以后即使增加反應(yīng)時間產(chǎn)率也不再增加。我們分辨選用EDC·HCl，DCC和DIC[24-26]作為縮合劑。實驗結(jié)果表明DCC更加合適，因為它可以提高反應(yīng)物溶解度從而提高反應(yīng)速率。

11、此外，該產(chǎn)品使用了不同比例的反應(yīng)物，當(dāng)1和3以低于1：1.2摩爾比反應(yīng)時，只有5生成，而，當(dāng)物料比大于1:1.2時，得到5和6的混合物。而且，5與6的在體系中產(chǎn)量隨著3的比例增大而增加。當(dāng)物料比達(dá)到1：4時，產(chǎn)量達(dá)到最大值，5和6的產(chǎn)率分別為62.3%和28.6%。</p><p><b>　　2.2 化學(xué)性質(zhì)</b></p><p>　　化合物5的結(jié)構(gòu)經(jīng)過光譜(MS

12、,IR,1H-NMR,13C-NMR)和元素分析數(shù)據(jù)來確證。質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示負(fù)離子模式下呈現(xiàn)離子峰489.0(M-H)和 978.8(2M-H)，同時，正離子模式下呈現(xiàn)513.1(M+Na),1018.9(2M+K)和1508.6(3M + K)。因此，質(zhì)譜數(shù)據(jù)跟計算出的預(yù)計分子式是一致的。紅外光譜顯示NH的兩個特征吸收譜帶分別為3,112cm-1 和1,458cm-1，C=O伸縮振動為1,756 cm-1。 在氫譜中，5.971ppm和1

13、1.950ppm為嘧啶上NH，但化合物1的C3-OH峰很快消失。在13C-NMR譜162.28 ppm處出現(xiàn)C-O信號?；?D-NMR光譜分析（gCOSY，gHMQC 和gHMBC），證明反應(yīng)發(fā)生在C3-OH，因為水平線跟垂直線分別被波峰在 1H-NMR 5.834 ppm 和13C-NMR處166.787ppm切割，顯示黃酮C3上的C-H基團(tuán)與5-氟尿嘧啶-羧酸（4）上的?；噙B。(如圖 2)</p><p>

14、;　　化合物6的結(jié)構(gòu)經(jīng)過光譜(IR, 1H-NMR, 13C-NMR)和元素分析數(shù)據(jù)的確定，紅外光譜顯示兩個NH特征吸收頻率為3,078 cm?1和1,472 cm?1?；衔?上的三個羥基（(C3-OH, C7-OH 和 C4’-OH）的信號不能在H譜上顯示出來。根據(jù)之前對化合物5的描述可知，縮合反應(yīng)發(fā)生在第一個C3-OH上。氫譜上C7-OH的信號將會消失但加熱后又會出現(xiàn)。此外，化合物6上的C3’-OH和 C5’-OH的氫信號可以在9

15、.769 ppm處觀察到，這與化合物5在9.003 ppm處出現(xiàn)不一樣。因此，可以確定縮合反應(yīng)發(fā)生在C3-OH 和 C4-OH位置上。經(jīng)過熱重分析（TGA）顯示，化合物5是以三水合物的形式存在，而化合物6是以四水合物的形式存在?；衔?和6中的結(jié)晶水可能是在儲藏時從環(huán)境中引入的。</p><p>　　2.3 生物活性方面</p><p>　　這些新的衍生物的抗癌活性通過MTT法測定評估，選

16、用K562 和K562/ADR [28]白血病細(xì)胞株。將細(xì)胞用化合物5和6處理24小時，48小時和72小時。IC50的值參照表1。在48小時，化合物5和6的抑制作用達(dá)到最大值，且不會隨反應(yīng)時間的增加而增大。在K562細(xì)胞株中，化合物5和6的IC50沒有顯著差異，當(dāng)同5-FU聯(lián)合給藥時，5-Fu與之形成的混合物沒有顯示出加和效應(yīng)。然而，在K562/ADR細(xì)胞株中顯示，這些新化合物中化合物5的抗癌作用比AMP和混合物更有效，顯示出對耐藥癌細(xì)

17、胞的潛在抗癌效果。此外，對ADR的IC50值在K562 和K562/ADR細(xì)胞株中分別為1.26 ± 0.15 μmol/L 和 50.52 ± 4.03 μmol/L，數(shù)據(jù)顯示K562/ADR細(xì)胞株對ADR有明顯的抵抗作用。</p><p>　　我們進(jìn)一步研究了化合物5和6在K562/ADR細(xì)胞株中的逆轉(zhuǎn)耐藥性。在這個實驗中，目前分別檢測維拉帕米，化合物5、6，AMP，5-FU，AMP-5-

18、FU在ARD中的IC50值（見表2）。選擇0.625 μmol/L和1.25 μmol/L兩種濃度是因為當(dāng)單獨(dú)使用此濃度的所有化合物沒有顯示出顯著的細(xì)胞毒素（抑制率≤10%）。結(jié)果顯示，在K562/ADR細(xì)胞株中化合物5和維拉帕米有顯著的逆轉(zhuǎn)耐藥性，且比AMP和5-FU的混合物更加有效。在濃度為0.625 μmol/L時，化合物5的逆轉(zhuǎn)作用比相同濃度的維拉帕米強(qiáng)。在濃度為1.25 μmol/L時，化合物6也有微弱的作用。在目前低濃度的新

19、化合物中，逆轉(zhuǎn)作用的貢獻(xiàn)在于增加癌細(xì)胞對藥物不良反應(yīng)的敏感性。盡管內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步查明，我們的研究表明，5-FU取代AMP的衍生物在癌癥的藥物耐藥性中有巨大的使用潛力。</p><p><b>　　3．實驗部分</b></p><p><b>　　3.1 儀器</b></p><p>　　IR光譜（用KBr壓片）Bruk

20、er EQUINOX 55 FTIR Spectrometer.1H-NMR和13C-NMR以DMSO為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)，Varian INOVA 500NB超導(dǎo)核磁共振譜儀。質(zhì)譜儀：Thermo LCQ DECA XP Spectrometer，以電噴霧電離（ESI）技術(shù)，雙聚焦質(zhì)譜儀以快原子轟擊FAB技術(shù)。</p><p>　　3.2 5-氟尿嘧啶-1-乙酸的合成</p><p>　

21、　5-FU（6.5 g, 50 mmol），氫氧化鉀（5.6 g, 100 mmol）溶于水（20 mL）混合加入到氯乙酸（7.16 g, 75 mmol）溶于水（15 mL），使混合物在室溫下攪拌30min。滴加10%的氫氧化鉀溶液使反應(yīng)液的PH值為10。之后回流2小時，冷卻，用濃鹽酸調(diào)PH至5.5，在4°C下靜置冷卻2小時，有晶體析出，抽濾，濾液作進(jìn)一步的處理。溶液中滴加濃鹽酸使PH值為2，在4°C下靜置冷卻2小

22、時。溶液中有晶體析出。產(chǎn)品完全溶解在飽和碳酸氫鈉溶液中進(jìn)行重結(jié)晶，使用濃鹽酸產(chǎn)生白色針狀沉淀?；衔?的光譜數(shù)據(jù)與[27]記錄的相同。</p><p>　　3.3 化合物5與6的合成</p><p>　　將THF (10 mL)加入到化合物1（0.10 mmol），3（0.40 mmol）和DCC（0.45 mmol）的混合物中，在室溫下攪拌反應(yīng)6小時，抽濾，蒸發(fā)濾液。利用硅膠制作的柱層析

23、使殘留物分離（以二氯甲烷-丙酮為展開劑），同時用薄層色譜法監(jiān)測。收集和結(jié)合了包含兩種產(chǎn)品的第二段和第三段色帶。這兩部分收集品在室溫下蒸干和重結(jié)晶，分別得到化合物5和6。測定熔點(diǎn)，進(jìn)行1H-NMR，13C-NMR，IR和MS分析。</p><p>　　化合物5，黃色固體；收率63%；熔點(diǎn)282–283 °C；IR (KBr) νmax (cm?1): 3,295 (OH), 3,112 (NH), 3,0

24、15 (C=C), 1,756 (C=O), 1,643 (C=O), 1,458 (NH); 1H-NMR (DMSO) δ (ppm): 4.424 (dd,J = 17.7Hz, 2H, CH2), 5.378 (d, J = 11.1 Hz,1H, 2-H), 5.856 (d, J = 11.1 Hz, 1H,3-H), 5.921 (d, J = 2.1 Hz, 1H, 8-H), 5.951 (d, J = 2.1 Hz,

25、 1H, 6-H), 6.419 (s, 2H, 2’-H， 6’-H), 7.976(d, J = 7.1 Hz, 1H, 5-FU-6-H), 8.328 (s, 1H, 4’-OH), 9.004 (s, 2H, 3’-OH+ 5’-OH), 11.023 (s, 1H,7-OH), 11.356 (s, 1H, 5-OH), 11.950 (s, 1H, 5-FU-3-NH); 13C-NMR</p><p&

26、gt;　　化合物6，黃色固體；收率28.6%；熔點(diǎn)291–293°C；IR (KBr) νmax (cm?1): 3,218 (OH), 3,078 (NH), 1,774 (C=O), 1,638 (C=O), 1,472 (N-H); 1H-NMR (DMSO) δ (ppm): 4.4609 (dd, J = 17.72 Hz,2H, CH2), 4.8118 (s, 2H, CH2), 5.5219 (d, J = 4

27、.88 Hz, 1H, CH), 5.8913 (d, J = 4.08 Hz, 1H, CH),5.9588 (s, 2H, CH), 6.5256 (s, 2H, 2CH), 7.9248 (d, J = 18.24 Hz, 2H, 2CH), 9.7618 (s, 2H, 2OH),11.3337 (s, 1H, OH), 11.9410 (s, 2H, NH); 13C-NMR (DMSO) δ (ppm): 48.03 (CH

28、2), 48.08 (CH2),72.92 (CH), 79.43 (CH), 95.49 (CH), 96.56 (CH), 100.37</p><p><b>　　3.4．生物學(xué)評價</b></p><p>　　細(xì)胞增長抑制測定：K562細(xì)胞株是從中國廣州中山醫(yī)院提供，K562/ADR腫瘤細(xì)胞株是從中國天津的中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究提供。這些細(xì)胞被培養(yǎng)

29、在添加了10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基的潮濕環(huán)境中(37 °C 5% CO2)。根據(jù)文獻(xiàn)中[28–29]MTT法的描述，細(xì)胞以1 × 104每孔的密度接種在96孔的培養(yǎng)板上，每組4個孔。每個孔在ADR的濃度為1.95 μmol/L 到 250 μmol/L之間的100 μL中分別培養(yǎng)24，48和72個小時，而其他組的濃度通過接連1：2稀釋降低到0.625 μmol/L 至 80 μmol/L范圍。接著每個培

30、養(yǎng)孔中添加MTT溶液（PBS稀釋，5 mg/mL, 20 μL）培養(yǎng)4小時。在2,000 rpm離心10分鐘后，每個孔中加入DMSO (200 μL)使聚集在一起的產(chǎn)品分散，在570nm下測吸光度。所有的測量進(jìn)行了進(jìn)行了三份，每個實驗重復(fù)做6次。</p><p><b>　　4．結(jié)論</b></p><p>　　總之，本文首次報道了關(guān)于5-FU取代白蘞素衍生物的合成及