八棱海棠種子中蘋果潛隱性病毒的分布特征及脫除技術(shù)研究.pdf

1、病毒病嚴(yán)重影響蘋果的樹體生長及果實(shí)品質(zhì)，目前尚無有效的防治藥劑，一旦侵染就很難根除，因此培育無病毒苗木實(shí)行無毒化栽培成為防治蘋果病毒病的有效途徑。目前，我國生產(chǎn)上普遍應(yīng)用的蘋果苗木多為喬砧和矮化中間砧苗木，兩種苗木均以實(shí)生苗為砧木（基砧）。八棱海棠（Malus robusta Rehd.）實(shí)生苗根系發(fā)達(dá)、適應(yīng)性強(qiáng)、耐鹽堿，是我國北方蘋果主產(chǎn)區(qū)應(yīng)用最為廣泛的蘋果砧木之一。長期以來，人們普遍認(rèn)為實(shí)生苗不攜帶病毒，但在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)有些實(shí)生苗

2、表現(xiàn)出病毒病的癥狀。為了明確八棱海棠種子是否攜帶蘋果潛隱性病毒，本研究以河北懷來八棱海棠種子為試材，運(yùn)用多重RT-PCR技術(shù)，研究分析了八棱海棠種子的帶毒情況、不同藥劑對種子病毒的脫除效果以及八棱海棠種子病毒的分布特征。主要結(jié)果如下:
　　 1.以八棱海棠果實(shí)及種子為試材，研究了其適宜的總RNA提取方法。結(jié)果表明，寶生物公司生產(chǎn)的RNAiso Plus和RNAiso-mate for Plant Tissue兩種試劑結(jié)合使用適宜

3、枝皮組織、種子及種胚高質(zhì)量RNA的提取，但不適用于果皮和果肉;適宜果皮和果肉總RNA提取的試劑為天根生化科技有限公司生產(chǎn)的RNAplant植物總RNA提取試劑。
　　 2.運(yùn)用多重RT-PCR技術(shù)對隨機(jī)采取的八棱海棠種子進(jìn)行蘋果潛隱性病毒檢測，結(jié)果表明，種子攜帶蘋果莖溝病毒和蘋果褪綠葉斑病毒，總體帶毒率為33％，復(fù)合侵染率為4％，蘋果莖溝病毒帶毒率為28％，蘋果褪綠葉斑病毒帶毒率為9％，但未檢測出蘋果莖痘病毒。
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4、.以確定帶毒母樹的果實(shí)為試材，對果實(shí)的不同部位進(jìn)行了潛隱性病毒檢測。結(jié)果表明:不同發(fā)育期果實(shí)果皮、果肉和種子的帶毒情況存在一定差異。果實(shí)膨大期的果皮果肉均攜帶蘋果莖溝病毒和蘋果褪綠葉斑病毒，但只有53.33％的果皮和13.33％的果肉攜帶蘋果莖痘病毒;成熟果實(shí)果皮果肉同時(shí)攜帶蘋果莖溝病毒、蘋果褪綠葉斑病毒和蘋果莖痘病毒三種潛隱性病毒;膨大期果實(shí)的種子均攜帶蘋果莖溝病毒和蘋果褪綠葉斑病毒，蘋果莖痘病毒病毒帶毒率為88.23％;成熟果實(shí)種子

5、蘋果莖溝病毒帶毒率69.23％，蘋果褪綠葉斑病毒帶毒率為53.25％，蘋果莖痘病毒帶毒率為42.86％。對帶毒母樹種子的種胚進(jìn)行病毒檢測，種胚的蘋果莖溝病毒帶毒率為25％，蘋果褪綠葉斑病毒帶毒率為8.34％，種胚未檢測到蘋果莖痘病毒。
　　 4.以帶毒母樹上采集的種子為試材，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)對清洗浸泡的種子進(jìn)行蘋果潛隱性病毒檢測。結(jié)果表明，清洗后蘋果莖溝病毒帶毒率下降到64％，蘋果褪綠葉斑病毒帶毒率下降到26％，而未檢測到蘋

6、果莖痘病毒。
　　 5.理化處理能夠脫除種子攜帶的病毒，本研究以隨機(jī)采取的八棱海棠種子為試材，采用80℃的熱水、10％的磷酸三鈉溶液、1％高錳酸鉀溶液和2％的氫氧化鈉溶液分別浸種30min，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測不同處理種子的帶毒率，并對處理后的種子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。結(jié)果表明，各個(gè)處理均能不同程度地降低八棱海棠種子的帶毒率。其中熱水處理對脫除蘋果莖溝病毒無效，高錳酸鉀和磷酸三鈉效果較好，脫毒效率為42％，而氫氧化鈉效果最好，脫毒效

7、率為82％。理化處理均不同程度的影響了種子的萌發(fā)力，其中熱水處理的發(fā)芽率和發(fā)芽勢下降幅度最大。
　　 6.為篩選脫毒率高且對種子萌發(fā)力負(fù)效應(yīng)較小的處理組合，對氫氧化鈉浸種處理進(jìn)行了優(yōu)化，分別設(shè)置了1％和2％的2個(gè)濃度組合和10min、20 min、30 min、40 min和60 min5個(gè)時(shí)間組合對氫氧化鈉的浸種處理進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，1％氫氧化鈉浸種脫除種子潛隱性病毒的效果不明顯;2％氫氧化鈉不同時(shí)間處理之間脫除效果存在一

8、定的差異，氫氧化鈉溶液浸種20min、30min和40min時(shí)，脫除效率較高且相近，綜合考慮處理的脫毒效果及其對萌發(fā)力的影響，2％氫氧化鈉浸種20min-30min為最佳的理化處理組合。
　　 為篩選出更適宜的處理組合，以懷來八棱海棠采種圃帶毒母樹種子為試材，用1.5％氫氧化鈉分別浸種20min、30min和40min，對氫氧化鈉處理組合做了進(jìn)一步的優(yōu)化。結(jié)果表明，1.5％氫氧化鈉浸種處理40min和2％氫氧化鈉浸種處理30mi