百脈根SUPERMAN類似基因ZFP3的表達(dá)分析及功能研究.pdf

1、植物SUPERMAN類鋅指蛋白屬于C2H2型鋅指蛋白，這類蛋白只含一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，其N端具有保守序列QALGGH，C端有一段富含亮氨酸的保守序列L(I)DLXLR(K)L，研究表明SUPERMAN基因在植物花發(fā)育、種子和胚的發(fā)育以及側(cè)根和分枝發(fā)育過(guò)程中起重要作用。本研究以百脈根為實(shí)驗(yàn)材料，利用生物信息學(xué)方法在百脈根數(shù)據(jù)庫(kù)中找到了一個(gè)參與根和根瘤發(fā)育的SUPERMAN類基因ZFP3，通過(guò)序列比對(duì)、同源性分析、啟動(dòng)子分析、和遺傳轉(zhuǎn)化等方法研

2、究了該基因的蛋白結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式和生理功能。主要的研究結(jié)果如下:
　　 1.利用已經(jīng)報(bào)道的擬南芥、矮牽牛、大豆等物種中的SUPERMAN類蛋白序列比對(duì)百脈根數(shù)據(jù)庫(kù)，找到了一個(gè)可能參與豆科植物根瘤發(fā)育過(guò)程的SUPERMAN類基因LjZFP3。SUPERMAN類鋅指蛋白屬于TFⅢA型轉(zhuǎn)錄因子，有一個(gè)典型的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域和一段高度保守的氨基酸序列QALGGH，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。
　　 2.在PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)

3、中分析ZFP3基因上游的1.82kb的序列，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)含有結(jié)瘤基因啟動(dòng)子中特有的典型的調(diào)控結(jié)瘤基因表達(dá)的保守作用元件5'-AAAGAT-3'，四個(gè)晚期結(jié)瘤素基因特有的啟動(dòng)子元件5'-CTCTT-3'和四個(gè)根特異性表達(dá)元件5'-ATATT-3'，分析結(jié)果暗示該基因可能在根與根瘤中特異表達(dá)。
　　 3.為了檢測(cè)ZFP3基因的時(shí)空表達(dá)，我們構(gòu)建了ZFP3Pro∶GUS重組質(zhì)粒，利用毛根轉(zhuǎn)化體系，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入豆科植物百脈根的根

4、中，進(jìn)行組織化學(xué)定位分析。結(jié)果顯示ZFP3主要在根的維管束中表達(dá)，在根瘤原基中不表達(dá)，在發(fā)育的根瘤中ZFP3基因的表達(dá)量較高，而成熟和衰老的根瘤中ZFP3的表達(dá)量很低。Real-time PCR結(jié)果顯示ZFP3基因在接種和未接種的根中均有表達(dá)，在接種根瘤菌2天后表達(dá)明顯上升，而后則趨于穩(wěn)定;ZFP3基因在不同時(shí)期的根瘤中均有表達(dá)，表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。啟動(dòng)子實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Real-time PCR結(jié)果證實(shí)了ZFP3基因的在根與根瘤中都有表達(dá)

5、，說(shuō)明這個(gè)基因可能參與根及根瘤發(fā)育的調(diào)控。
　　 4.利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)下調(diào)表達(dá)ZFP3基因，結(jié)果顯示ZFP3的RNAi不僅導(dǎo)致了RNAi植株結(jié)瘤數(shù)目明顯減少而且影響了植株的根的正常生長(zhǎng)。這個(gè)結(jié)果證實(shí)ZFP3在根與根瘤的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮正調(diào)控作用。
　　 5.利用毛根轉(zhuǎn)化技術(shù)將LjZFP3導(dǎo)入百脈根中超量表達(dá)，觀察接種根瘤菌后根瘤的表型，結(jié)果顯示超表達(dá)LjZFP3植株的結(jié)瘤數(shù)沒(méi)有明顯的變化，但是超表達(dá)植株中成熟