柑橘硼運輸基因CiNIP5和CiNIP6的克隆和功能鑒定.pdf

1、柑橘是世界范圍內(nèi)普遍種植的一類非常重要的經(jīng)濟作物，而它在中國的主要種植區(qū)之一贛南的土壤中嚴重缺乏硼素，導(dǎo)致柑橘花而不實或者“猴頭果”，降低了柑橘產(chǎn)量，從而影響果農(nóng)的經(jīng)濟收入。硼是植物生長必需的微量元素，它在土壤中存在的主要形式是B(OH)3，并以中性分子的形式為植物所吸收和運輸。植物對硼素的濃度適應(yīng)范圍比較窄，硼素濃度過低或過高對植物生長都會造成不利的影響。在雨水過多地方如江西贛南地區(qū)，硼素很容易被雨水淋失而使作物出現(xiàn)缺硼癥狀;而在干旱

2、地區(qū)如澳大利亞，因灌溉水含硼量過高或者施用過量硼肥而硼在土壤中累積造成植物硼毒害。雖然硼素對作物的經(jīng)濟價值影響非常大，但是目前人們對硼素的代謝路徑尚不清楚。近期的研究表明，植物中特有的一類水通道蛋白—NIP家族蛋白參了硼素的吸收和運輸過程，NIP家族基因運輸硼、甘油等大分子的功能成為研究熱點。目前在擬南芥、水稻、葡萄等作物中已經(jīng)克隆得到與硼吸收和運輸有關(guān)的基因，但是在柑橘中還未見報道。
　　 本研究利用電子克隆、染色體步移等技術(shù)

3、，從柑橘砧木枳[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]中克隆了兩個基因CiNIP5和CiNIP6及他們的啟動子，分析了基因編碼的氨基酸序列的保守性和多樣性，研究了他們在枳殼中組織特異表達模式和缺硼、硼毒害脅迫條件下的時空表達情況以及啟動子區(qū)域存在的關(guān)鍵元件。為了進一步的證實CiNIP5和CiNIP6與硼吸收和運輸?shù)年P(guān)系，還對這兩個基因進行功能驗證工作。本研究最終證實了柑橘中CiNIP5和CiNIP6分別參與了植株吸收和

4、運輸硼的過程，為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高柑橘耐硼脅迫環(huán)境提供了理論基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　 1.采用同源克隆技術(shù)從柑橘砧木枳中得到硼運輸基因CiNIP5，基因序列包含903bp的開放閱讀框，編碼300個氨基酸。預(yù)測CiNIP5編碼蛋白質(zhì)分子的分子量為31.0kDa，等電點為8.73。多序列比對和系統(tǒng)進化樹分析表明，CiNIP5屬于水通道蛋白家族中的NIP亞家族，與擬南芥中的AtNIP5;1有高度的相似性。生物信息學(xué)分析表明CiNIP

5、5蛋白具有典型的NPA和Ar/R結(jié)構(gòu)域，可以運輸比水分子大的中性小分子物質(zhì)?；虮磉_分析表明CiNIP5 mRNA主要在枳根部表達，在莖和葉中的表達量非常低。低硼脅迫下，CiNIP5 mRNA積累量顯著升高;在高濃度硼脅迫下，CiNIP5 mRNA積累量顯著降低。
　　 2.采用同源克隆技術(shù)從柑橘砧木枳中得到硼運輸相關(guān)基因CiNIP6，基因序列包含915bp的開放閱讀框，此開放閱讀框包含五個外顯子和四個內(nèi)含子，編碼304個氨基酸

6、。預(yù)測CiNIP6編碼蛋白質(zhì)分子的分子量為31.2kDa，等電點為8.61。多序列比對和系統(tǒng)進化樹分析表明CiNIP6屬于水通道蛋白家族中的NIP亞家族，與擬南芥中的AtNIP6;1有高度的相似性。生物信息學(xué)分析表明CiNIP6蛋白具有典型的 NPA和Ar/R結(jié)構(gòu)域，其中Ar/R組成為T，I，G和R不同于AtNIP6;1的結(jié)構(gòu)，推測CiNIP6具有不同于AtNIP6;1的功能?；虮磉_分析表明CiNIP6 mRNA主要在枳地上部位表達，

7、在根中的表達量非常低。在低硼和高硼濃度脅迫下，CiNIP6 mRNA積累量都顯著升高，說明CiNIP6參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)硼的平衡分布。
　　 3.應(yīng)用染色體步移技術(shù)克隆得到CiNIP5和CiNIP6基因啟動子。生物信息學(xué)分析表明這兩個基因的啟動子都具有典型的TATA box和CAAT box，并含有很多逆境響應(yīng)元件;如干旱、傷害等，還包含乙烯、赤霉素、生長素、光等激素和環(huán)境信號響應(yīng)元件。
　　 4.通過生物信息學(xué)分析，比對

8、發(fā)現(xiàn)CiNIP5的5端UTR和AtNIP5;1的5端UTR具有很高的相似性，都具有兩個保守序列:序列1(CAUGUAA)和序列2(UCAAAUCAUGUAA)。這兩個序列對于CiNIP5響應(yīng)環(huán)境中硼濃度而上調(diào)或下調(diào)變化起到?jīng)Q定性作用。
　　 5.通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將CiNIP5和CiNIP6基因轉(zhuǎn)入煙草中超表達進行功能分析。結(jié)果表明轉(zhuǎn)CiNIP5基因植株的細胞耐逆境能力增強，葉片的光合作用增強，根部累積的硼含量顯著增加;轉(zhuǎn)CiNI