靶除肌抑素基因體細胞克隆蒙古羊的研究.pdf

1、近幾年發(fā)現(xiàn)的抑制骨骼肌生長的負調(diào)控因子——肌肉生長抑制素(Myostatin，MSTN)，在遺傳突變后，導(dǎo)致基因功能的失活，進而引起動物肌肉過度發(fā)育，肌纖維數(shù)量增多，直徑增加，肌肉量急劇增加，動物表現(xiàn)為“雙肌”性狀。于是，研究者們通過對肌抑素基因進行敲除、缺失，突變等基因修飾，來獲得基因敲除的動物模型和克隆動物，以達到醫(yī)學(xué)上和農(nóng)業(yè)上的需求。對于本研究來說，蒙古羊是內(nèi)蒙古自治區(qū)的優(yōu)勢物種之一，培育產(chǎn)肉性狀優(yōu)良，產(chǎn)肉率高的蒙古羊?qū)τ谧灾螀^(qū)的

2、家畜育種具有重要意義。
　　本研究選用妊娠30天的蒙古羊胎兒為材料，通過組織塊貼壁法成功建立蒙古羊胎兒成纖維細胞系，用于MSTN基因的打靶實驗。同時利用基因敲除技術(shù)在體外構(gòu)建了針對蒙古羊MSTN基因的第三外顯子缺失的敲除載體。主要構(gòu)建了兩個帶有篩選標(biāo)記的置換型載體和一個無篩選標(biāo)記的TALEN敲除載體。主要結(jié)果如下:
　　1、委托華大基因測序公司對蒙古羊肌抑素基因進行測序，得到測序結(jié)果后與Genebank上發(fā)布的Ovies的M

3、STN基因序列進行比對，設(shè)計引物，成功克隆出蒙古羊肌抑素基因。
　　2、設(shè)計引物，利用PCR技術(shù)，成功擴增到蒙古羊MSTN基因的兩種同源長臂，大小分別為5600bp和6000bp，包括全部的exon1，intron1，exon2，intron2及部分啟動子和少部分exon3;同源短臂1100bp，包括部分exon3和3'非翻譯區(qū)序列，然后將同源長短臂分別連入帶有正負篩選標(biāo)記基因的pPNTⅢ和pEGF-N1的敲除骨架載體，分別用TA

4、克隆法和無縫克隆法成功構(gòu)建了針對MSTN基因第三外顯子缺失的置換型打靶載體，且酶切和測序鑒定均證明兩種置換型載體構(gòu)建都正確。
　　3、構(gòu)建了兩個針對蒙古羊肌抑素基因第三外顯子中的17個堿基突變的無篩選標(biāo)記的TALEN載體（197和198）和一個針對第二外顯子中的17個堿基突變的TALEN載體(199)。通過活性鑒定，驗證只有兩個具有敲除活性的TALEN載體(197和198)。
　　4、通過組織塊貼壁法建立蒙古羊胎兒成纖維細胞

5、系，且細胞系的生長狀態(tài)良好。將置換型載體和TALEN載體分別利用電轉(zhuǎn)染和LipofectamineTM2000介導(dǎo)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染蒙古羊胎兒成纖維細胞。通過藥物G418篩選和無限稀釋—口吸管法篩選單克隆細胞，并將得到的單細胞株部分用于鑒定是否敲除，部分凍存。之后，對篩選的單細胞株提取DNA，PCR，鑒定。將最終鑒定正確的20個TALEN基因敲除細胞株再次分別做PCR，將得到的PCR產(chǎn)物（即在第三外顯子包括靶位點的一段基因序列）連接到pMD-

6、19T上，菌落PCR，每個細胞株將隨機挑選15個單菌落樣品送測序，再一次鑒定是否在靶位點處有堿基的突變。最終的測序證明197中有4個雙等位基因缺失堿基的細胞株，而198中只有3個細胞株發(fā)生單堿基突變或缺失。
　　5、選擇用篩選出來的雙等位基因缺失的單克隆細胞株E20、P54、P66和P42（在靶位點附近分別缺失堿基19個、11個、8個和11個）做為供體細胞，成熟的卵母細胞去核后做為受體細胞，通過顯微注射法構(gòu)建了基因敲除的克隆重構(gòu)胚