體細(xì)胞克隆山羊表觀遺傳修飾與基因表達特征研究.pdf

1、盡管體細(xì)胞核移植在許多物種中獲得成功，但是獲得表型正?？寺游锏男蕝s非常低。供體細(xì)胞核的不完全重序被認(rèn)為是造成克隆胚胎不能正常發(fā)育到成年的首要原因。深入探討成年體細(xì)胞克隆動物中潛在的表觀遺傳修飾機制，將有助于了解關(guān)于克隆動物能夠正常發(fā)育的后成重序界限，強化SCNT中相關(guān)的倫理觀念。本研究以成年體細(xì)胞克隆山羊為研究對象，運用同源擴增、PCR克隆測序方法獲得山羊印跡基因差異甲基化(DMR)序列，并通過Southern雜交、實時定量RT-P

2、CR、SSCP等技術(shù)，進一步探索了成年克隆山羊印跡基因、DNA重復(fù)序列的甲基化模式，端粒長度以及生長相關(guān)印跡基因和非印跡基因的表達特征，深入探討甲基化對基因表達的調(diào)控模式。 1．山羊H19/IGF2和IGF2R第2內(nèi)含子DMR的克隆測序與分析 本實驗根據(jù)綿羊的DNA序列AJ566210保守區(qū)域設(shè)計引物擴增出山羊H19基因第一外顯子上游長4.2kb的調(diào)控區(qū)域序列，經(jīng)生物信息學(xué)分析，該序列具有和綿羊、人類和小鼠同樣的結(jié)構(gòu)(G

3、enbank登錄號：EF577239)。包含有4個鋅指蛋白CTCF結(jié)合位點，分別定位于轉(zhuǎn)錄起始部位上游4079bp(Ⅰ)、3646bp(Ⅱ)、2866bp(Ⅲ)和1221bp(Ⅳ)；4個CpG島，GC含量分別為63％、65％、61％和71％；該序列與綿羊的參考序列同源度達93.5％。 根據(jù)綿羊DNA序列AY182033保守區(qū)域設(shè)計引物擴增出山羊IGF2R第二內(nèi)含子DMR片段，并成功獲得上游809bp和下游576bp序列(中間區(qū)域

4、由于GC含量過高，無法測序；Genbank登錄號：EF577240)。經(jīng)BLAST分析確認(rèn)，與所參照序列同區(qū)域同源度平均為95.7％，GC含量分別為76％和67％。 2．成年體細(xì)胞克隆山羊H19和IGF2R基因DMR甲基化狀況分析 基因組DNA10μg用EcoR Ⅰ和甲基化敏感酶SacⅡ酶切后，與篩選出的H19基因上游特異性探針(地高辛標(biāo)記)進行Southern雜交。結(jié)果表明，在H19基因上游DMR，成年體細(xì)胞克隆山羊甲

5、基化程度均值(1.85±0.37)與年齡相近的對照組山羊均值(1.53±0.38)相比，差異不顯著；但是就個體而言，克隆山羊只有一只甲基化水平不在對照組均值范圍內(nèi)；卵巢顆粒細(xì)胞克隆山羊均值(1.84±0.39)與皮膚成纖維細(xì)胞克隆山羊均值(1.90±0.47)基本接近，表明不同的供核細(xì)胞類型來源并沒有對其甲基化狀況有什么影響；皮膚成纖維細(xì)胞克隆山羊平均值稍低于其供核體山羊。為了檢測成年體細(xì)胞克隆山羊IGD2R第2內(nèi)含子DMR的甲基化狀態(tài)

6、，基因組DNA10μg用HindⅢ和甲基化敏感酶sacⅡ酶切，Southem轉(zhuǎn)移后與特異性探針雜交。結(jié)果表明，成年克隆山羊甲基化均值(4.46±1.67)與年齡相近的對照組山羊均值(2.34±1.28)相比，差異顯著，表明成年克隆山羊IGF2R基因內(nèi)含子差異甲基化區(qū)域甲基化水平顯著高于同齡對照組動物；卵巢顆粒細(xì)胞克隆山羊均值(4.54±1.91)與2只皮膚成纖維細(xì)胞克隆山羊均值(4.19±0.99)基本接近，因此，在這個差異甲基化位點上

7、，不同的供核細(xì)胞類型并沒有對其甲基化狀況影響不大；皮膚成纖維細(xì)胞克隆山羊平均值則與其核供體山羊的甲基化程度相當(dāng)。 3．成年體細(xì)胞克隆山羊小衛(wèi)星DNA重復(fù)序列甲基化狀況分析 基因組DNA 5μg平均分成2等份，分別用甲基化不敏感內(nèi)切酶Msp Ⅰ消化和甲基化敏感性限制酶HpaⅡ消化后與人源小衛(wèi)星探針33.6雜交。結(jié)果表明，成年體細(xì)胞克隆山羊小衛(wèi)星DNA重復(fù)序列甲基化程度與自然繁殖山羊相比差異不顯著；成纖維細(xì)胞克隆山羊甲基化水

8、平(6.17±1.46)少于顆粒細(xì)胞克隆山羊的均值(6.89±4.15)，也低于其皮膚成纖維細(xì)胞供體山羊的7.96，但是顆粒細(xì)胞克隆變異系數(shù)較高。 4．體細(xì)胞克隆山羊端粒長度分析 本實驗用TRF法檢測了成年體細(xì)胞克隆山羊端粒長度。結(jié)果表明，成年克隆山羊耳皮膚組織端粒平均長度與同齡對照相比，差異不顯著，但是克隆山羊的變化范圍較大；皮膚成纖維克隆山羊端粒長度略大于卵巢顆粒細(xì)胞；繼代克隆山羊端粒長度略短于對照，但差異不顯著。說

9、明核移植以及連續(xù)核移植對克隆山羊端粒長度影響不大。 5．成年體細(xì)胞克隆山羊生長相關(guān)印跡基因表達分析 本實驗用Real-time PcR分析了成年體細(xì)胞克隆山羊印跡基因H19、IGF2和IGF2R mRNA表達情況。結(jié)果表明，克隆山羊和非克隆山羊J19基因和IGF2基因的表達并沒有顯著差異，而IGFR基因的表達水平核移植山羊極顯著高于普通山羊。2只皮膚成纖維細(xì)胞克隆山羊H19和IGF2基因的表達明顯低于顆粒細(xì)胞克隆山羊中的

10、表達量，而IGF2R基因的表達在二者中的表達基本相同。同時本實驗還H19和IGF2基因的定量PCR產(chǎn)物進行SSCP分析，結(jié)果表明，二者的單等位表達方式是一致的。 本實驗還獲得了山羊IGF2基因完整編碼區(qū)和3’非翻譯區(qū)。分析表明，山羊IGF2基因開放閱讀框(ORF)長度為540bp，編碼一個179氨基酸的蛋白。三種反芻動物相比，山羊IGF2 DNA序列與綿羊的同源性(99.47％)要高于牛(97.68％)。編碼的氨基酸序列與綿羊同

11、源性(98.88％)也高于牛(96.09％)。山羊IGF2基因GenBank登陸號為DQ645739。同時還獲得山羊H19和IGF2R基因部分序列，GenBank登陸號分別為：DQ666955和DQ666954。 6．成年體細(xì)胞克隆山羊生長相關(guān)非印跡基因表達分析 本實驗用Real-time PCR分析了成年體細(xì)胞克隆山羊非印跡基因IGF1、IGF1R、GHR和GHSR mRNA表達情況。結(jié)果表明，克隆山羊和非克隆山羊IG