我國地方品系雞群中ALV的流行病學調(diào)查及ALV-K生物學特性的研究.pdf

1、禽白血病病毒（Avian leukosis viruses,ALV）屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科（Retroviridae）α反轉(zhuǎn)錄病毒屬（Alpharetrovirus）的一類病毒。ALV感染不僅誘發(fā)多種腫瘤性疾病，還可引起大多數(shù)感染雞的亞臨床癥狀，如產(chǎn)蛋下降、免疫抑制或生長遲緩。根據(jù)病毒中和試驗和gp85的特性，迄今為止將ALV分為A-J十個亞群，以及新鑒定的K亞群。自20世紀90年代以來，禽白血病特別是J亞群禽白血病病毒（ALV-J）給我國的

2、養(yǎng)雞業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失，嚴重危害我國白羽肉雞、蛋用型雞、黃羽肉雞和固有的地方品種雞等各種類型雞的健康發(fā)展。先天垂直感染是ALV的重要傳播方式。由于宿主對ALV難以產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答反應(yīng)，加之ALV基因組變異頻率較快，至今為止，尚未有商品化的疫苗可用。由于ALV亞群的多樣性，感染和傳播的復(fù)雜性，給我國的養(yǎng)雞業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失，本研究對我國不同雞群進行了ALV的流行病學調(diào)查，并對公雞精液在ALV傳播中作用進行了系統(tǒng)的研究；通過研究不同

3、佐劑及免疫增強劑對ALV-J gp85重組蛋白誘導抗體的產(chǎn)生，從而加速和輔助我國ALV的凈化；對新分離到的ALV-K全基因組做了系統(tǒng)的分析，并研究了ALV-K的原型株JS11C1對SPF雞的致病性；本研究利用反向遺傳操作技術(shù)，構(gòu)建JS11C1株的感染性克隆，并在此基礎(chǔ)上首次構(gòu)建了env(J)-LTR(K)和env(K)-LTR(J)的嵌合感染性克隆，借以探究env基因在ALV-K的致病性中所發(fā)揮的作用。
　　1.我國不同雞群中AL

4、V的流行病學調(diào)查及其準種分析
　　本研究對我國12個不同地方品系雞群中ALV進行了分離鑒定，共分離鑒定到14株ALV，對這些分離毒株gp85基因進行了克隆測序和亞型鑒定，結(jié)果顯示有2株ALV-A，1株ALV-B，8株ALV-J和3株ALV-K。其中，2012年從山東某地方品系雞群發(fā)生疑似為血管瘤的腫瘤病例中分離到5株 J亞型 ALV-J，定名為SDLY1201-SDLY1205。分別擴增五株ALV-J的gp85基因，并對五個毒株準

5、種多樣性進行分析和比較。結(jié)果顯示：五個毒株其 gp85核苷酸長度分別為921bp、921bp、924bp、918bp、912bp，其不同克隆之間的氨基酸同源性分比為99.3％-100%、99.3%-100%、99.4%-100%、98.4%-100%、99.0%-100%，其中序列完全相同的克隆比例分別為13/20、17/20、17/20、9/18、16/19，代表了五個毒株中優(yōu)勢準種的比例，對五個毒珠優(yōu)勢準種的gp85比較顯示其氨基酸

6、同源性為89.2%-92.5%。本研究證實即使在同一時期同一雞群感染的不同個體中，ALV-J野毒株準種也存在巨大的差異，特別是其中優(yōu)勢準種發(fā)生了改變。
　　2.公雞精液在ALV傳播中的作用
　　長期以來，對ALV感染雞群過程中公雞的作用特別是對后代的傳播作用一直沒有得到明確的闡述。本研究通過雞胚靜脈接種J亞群禽白血病病毒（ALV-J），獲得持續(xù)病毒血癥的公雞，并將這些公雞的精液人工授精給產(chǎn)蛋期的母雞，1周后收集種蛋并孵化出雛

7、雞。結(jié)果顯示，兩只受精的母雞在4-5w時產(chǎn)生ALV-J的抗體，在6只母雞的泄殖腔中檢測到p27抗原，母雞產(chǎn)的26個雞蛋中檢測到3個蛋清P27為陽性。此外，對12只母雞進行病毒分離時發(fā)現(xiàn)，在授精后6w均沒有檢測到病毒血癥的存在。然而，1周齡時從34只后代的雛雞中的1只雛雞中分離到ALV-J，其與從公雞精液樣品中分離到的ALV-J的gp85基因的序列同源性為98.4％-99.2％。我們的研究表明，ALV-J可以通過公雞的精液的人工授精感染母

8、雞并且垂直傳播給子代的雛雞。這一發(fā)現(xiàn)對于改進和完善種雞場ALV凈化程序有重要的指導作用。
　　3.不同佐劑及免疫增強劑對ALV-J gp85重組蛋白誘導抗體產(chǎn)生的研究
　　原核表達的ALV-J gp85囊膜蛋白能夠誘導SPF雞產(chǎn)生抗體，但抗體陽性率和抗體水平均較低，本研究觀察了免疫增強劑松花粉多糖（TPPPS）聯(lián)合不同佐劑（CPG、YF01）對增強ALV-J gp85囊膜蛋白免疫后抗體水平的影響。結(jié)果顯示，單一gp85重組蛋

9、白只能誘導少數(shù)雞產(chǎn)生抗體，且產(chǎn)生的抗體效價較低、維持時間較短；而YF01或CpG佐劑分別聯(lián)合重組蛋白能夠使大部分免疫雞產(chǎn)生抗體，且效價較高，當兩種佐劑再聯(lián)合使用免疫增強劑泰山松花粉多糖后能夠使產(chǎn)生的高效價抗體維持時間更長。對ALV-J抗體水平較高的4組收集種蛋進行孵化檢測母源抗體，人工攻毒后觀察母源抗體對雛雞的保護效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)添加免疫增強劑TPPPS組產(chǎn)生的母源抗體水平較沒有添加組高，且對雛雞具有較高的保護效力，與對母體的使用效果

10、一致。通過本研究我們可以發(fā)現(xiàn)泰山松花粉多糖聯(lián)合使用YF01和CPG佐劑可以增強gp85重組蛋白的免疫原性，產(chǎn)生較好的免疫保護作用，這將為開發(fā)更加有效的ALV-J亞單位疫苗提供有力實驗依據(jù)，高效亞單位疫苗的研制也將為J亞群禽白血病的凈化提供更大的幫助。
　　4.K亞群ALV的全基因組分析及其致病性研究
　　本研究從我國地方品系雞群中分離鑒定到了3株ALV-K，并對其做了全基因組分析，結(jié)果表明，這3株ALV-K與之前已發(fā)表的AL

11、V-K毒株位于一個單獨的分支，與雞群中其他已知亞群的ALV均不在同一分支中。其中，與SDAUAK-11、SDAUAK-12和SDAUAK-13的全基因序列同源性最高的分別為中國廣東分離株 GD14LZ，GDFX0601，江蘇分離株JS11C1，與其它ALV-K毒株的同源性分別為90.8%-97.7%，90.8%-97.7%，91.2%-97.3%。為研究ALV-K的致病性，將2011年分離自中國某地方品系雞的ALV-K原型株JS11C1

12、株分別采用卵黃囊接種、雞胚靜脈接種和1日齡腹腔接種三種方式感染SPF雞，系統(tǒng)記錄分析了感染雞群的病毒血癥和抗體產(chǎn)生動態(tài)、對感染雞群體重增重的抑制以及感染雞群對疫苗免疫應(yīng)答的影響等方面，以對JS11C1的致病性進行全面評估。結(jié)果表明，當通過卵黃囊接種和雞胚靜脈接種時，JS11C1可以誘發(fā)感染雞的持續(xù)病毒血癥，抑制感染雞群的體重增重和對疫苗的免疫應(yīng)答，并可誘發(fā)一定比例的淋巴細胞腫瘤。相對于其他亞群ALV，JS11C1的傳播效率和致病性相對較

13、弱。本研究系統(tǒng)研究了JS11C1株對SPF雞的致病性，為下一步研究其致病機制和科學防控奠定了基礎(chǔ)。
　　5.env基因在ALV-K致病作用中的研究
　　在所有亞群ALV中，ALV-J致病性最強，而ALV-K與ALV-A、B等類似。為了闡明env基因和LTR片段在ALV-J與ALV-K致病性差異的作用，本研究構(gòu)建和比較了ALV-J野毒株SDAU1005和ALV-K野毒株JS11C1及其重組嵌合病毒renv(J)-LTR(K)和

14、renv(K)-LTR(J)的感染性克隆的生物學特性。在這4個感染性克隆病毒中,rSDAU1005（ALV-J）在DF-1細胞上的復(fù)制能力最強，rJS11C1最弱，而2個重組病毒介于二者之間，其強度次序rSDAU1005＞renv(K)-LTR(J)＞renv(J)-LTR(K)＞rJS11C1。此外，在與致病性相關(guān)的對增重、對法氏囊和胸腺發(fā)育及疫苗免疫后抗體反應(yīng)的抑制作用上，這一比較結(jié)果表明，env基因和LTR片段在影響ALV-J與A