基于納米磁珠與化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)廣西巴馬小型豬PERV的研究.pdf

1、為解決人源器官?lài)?yán)重短缺的問(wèn)題,人們希望利用動(dòng)物器官進(jìn)行異種移植。經(jīng)多方考慮,人們選擇豬作為最合適的供體。而豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(Porcine endogenous retrovirus,PERV)普遍存在于各類(lèi)豬種中,且能夠感染人類(lèi)細(xì)胞,引起了人們的高度重視。廣西巴馬小型豬具有體型小、遺傳穩(wěn)定、遺傳背景清晰等優(yōu)點(diǎn),是異種移植的良好供體。為開(kāi)發(fā)巴馬小型豬種資源,篩選PERV低拷貝豬,為異種移植提供安全可靠的豬源器官,本研究利用納米磁珠（m

2、agnetic nanoparticles,MNPs)與化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence,CL)技術(shù),建立了一種基于納米磁珠與化學(xué)發(fā)光的PERV檢測(cè)方法,并應(yīng)用該方法進(jìn)行了廣西巴馬小型豬PERV前病毒的檢測(cè)研究,主要內(nèi)容包括:
　　1、納米磁珠的制備及其在血液DNA提取中的應(yīng)用
　　采用溶劑熱法制備出Fe3O4納米磁珠,在其表面進(jìn)行SiO2包覆,得到Fe3O4@SiO2復(fù)合磁珠,并進(jìn)行氨基化及羧基化修飾,獲得羧基

3、功能化納米磁珠(CMNPs)。經(jīng)透射電子顯微鏡(TEM)、掃描電子顯微鏡(SEM)表征,粒徑分析,化學(xué)基團(tuán)的傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)測(cè)定,以及振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)分析得出:該磁珠形貌良好、粒徑均勻、磁性好且為超順磁性。另外,所制備的Fe3O4@SiO2磁珠能夠很好地應(yīng)用于巴馬小型豬的血液基因組DNA的提取。
　　2、基于納米磁珠與化學(xué)發(fā)光的PERV檢測(cè)方法的建立與優(yōu)化
　　利用CMNPs作為固相載體,分別以pol

4、、env-A、env-B與env-C片段為目標(biāo)分子,經(jīng)過(guò)生物素標(biāo)記PCR擴(kuò)增、固相雜交反應(yīng)、SA-ALP孵育、加入 AMPPD發(fā)光的步驟,建立了一種 PERV及 PERV-A、PERV-B、PERV-C三種亞型的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法。結(jié)果表明,該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高。經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化得到最優(yōu)檢測(cè)體系為:1 mM的SA修飾濃度,10μM的探針修飾濃度,55℃(PERV)、54℃(PERV-A)、50℃(PERV-B)、56℃(PERV-C)的雜交

5、溫度,30 min的雜交時(shí)間。3、廣西巴馬小型豬PERV相對(duì)拷貝數(shù)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)
　　建立了GAPDH化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法,結(jié)合上述建立的PERV及其亞型的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法,進(jìn)行了PERV及其三種亞型前病毒在20頭廣西巴馬小型豬基因組中的相對(duì)拷貝數(shù)的檢測(cè)與分析。結(jié)果表明,PERV的相對(duì)拷貝數(shù)在0.94±0.10至6.79±0.59之間,PERV-A的相對(duì)拷貝數(shù)在1.01±0.13至7.26±0.64之間,PERV-B的相對(duì)拷貝數(shù)為0.74