山羊RanBP9和CD320基因克隆、組織表達(dá)與多態(tài)性分析.pdf

1、精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法(sperm-mediated gene transfer，SMGT)是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的有效途徑，具有簡(jiǎn)便、高效等特點(diǎn)，但機(jī)制至今不明確，成了限制這種方法發(fā)展運(yùn)用的瓶頸和世界性難題，造成SMGT存在著極大的隨機(jī)性和不確定性。目前國(guó)際上對(duì)此研究較少，且主要集中在CD4分子上。眾多蛋白質(zhì)之間在許多重要的生命活動(dòng)中都是彼此協(xié)調(diào)和控制的，基因組中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。我們前期研究證明CD4分子在山羊精子結(jié)合

2、內(nèi)化外源DNA過程中起到主要作用，并以其為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交系統(tǒng)，篩選與CD4相互作用的8個(gè)候選分子。本研究對(duì)其中兩個(gè)主要的候選分子:RanBP9和CD320，進(jìn)行基因克隆、序列分析、組織表達(dá)與基因多態(tài)性分析，為進(jìn)一步揭示這些候選分子在山羊精子轉(zhuǎn)運(yùn)外源DNA的作用，深入研究精子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　RanBP9（Ran binding protein9，Ran結(jié)合蛋白9）在胚胎干細(xì)胞中可以自行發(fā)育，且在精子和卵子

3、發(fā)生過程中具有重要調(diào)節(jié)作用。CD320參與體內(nèi)免疫反應(yīng)，扮演受體重要角色，能夠介導(dǎo)物質(zhì)和信號(hào)的轉(zhuǎn)移與轉(zhuǎn)運(yùn)。由于在山羊上這兩個(gè)基因的研究尚屬空白，本研究參考GenBank發(fā)表的其他物種的序列，在高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，通過RT-PCR方法克隆山羊RanBP9和CD320基因，并對(duì)其核苷酸序列、氨基酸序列及預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。同時(shí)，檢測(cè)RanBP9和CD320基因在山羊不同組織中的表達(dá)水平。最后，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—單鏈構(gòu)象多

4、態(tài)性（PCR-single stranded conformational polymorphism，PCR-SSCP）技術(shù)，分析CD320基因在大足黑山羊和南江黃羊的遺傳多態(tài)性。主要結(jié)果如下:
　　1.首次克隆了山羊RanBP9基因（GenBank登錄號(hào):KF425511.1）和CD320基因（GenBank登錄號(hào):KF425510.1），cDNA序列分別為1008bp和517bp。
　　2.RanBP9的開放閱讀框(OR

5、F)為936bp，位于2～937bp，編碼312個(gè)氨基酸殘基，在937bp處和2bp分別有加信號(hào);CD320的ORF長(zhǎng)459bp，編碼153個(gè)氨基酸;在463bp處和2bp分別有加信號(hào)。采用SMART程序分析表明，山羊RanBP9氨基酸序列中1-54bp和72-196bp處為未知區(qū)域，55-71bp處為低耦合區(qū)域，197-299bp處為智能區(qū)域;CD320氨基酸序列中100-122bp處為低密度脂蛋白受體結(jié)構(gòu)域，18-56bp處為跨膜區(qū)

6、。用BLAST進(jìn)行序列比對(duì)顯示，山羊RanBP9基因與恒河猴（Macaca mulatta）、大猩猩（Gorila gorilla）、人(Homo sapiens)、小鼠（Mus musculus）和蜥蜴（Japalura brevipes）的同源相似性都很高，達(dá)99％;與牛(Bos taurus)、蟾蜍（Fel bufonis）和斑馬魚(Danio rerio)的同源相似性分別為86％、83％和75％;山羊CD320基因與綿羊（Ovi

7、s aries）、牛（Bos taurus）同源相似性分別是98％、96％，與海豚（Takifugu rubripes）、虎（Panthera tigris）、鯨魚（Orcinus orca）、大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)、馬(Equuszebra)和家貓（Pardofelis marmorata）的同源相似性分別是83％、77％、76％、75％、74％和73％。用expasy網(wǎng)站對(duì)蛋白疏水性預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示Ra

8、nBP9疏水性峰值負(fù)值較高，為親水性;CD320疏水性峰值正值較高，為疏水性。用TMPRED對(duì)蛋白進(jìn)行跨膜性預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示RanBP9在281-298bp處出現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)，CD320在103-122處出現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)，二者均為跨膜蛋白。對(duì)兩種蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)位點(diǎn)分析，顯示RanBP9蛋白存在3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、2個(gè)多糖鏈接位點(diǎn)和7個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn);CD320蛋白含有5個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、3個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)酰胺化位點(diǎn)和2個(gè)異戊烯基

9、結(jié)合位點(diǎn)。在NCBI上進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析，二者均未檢測(cè)出信號(hào)肽。
　　3.采集大足黑山羊心、肝、脾、肺、腎、胰臟、肌肉、睪丸、卵巢和胸腺等組織樣品，并提取總RNA，采用半熒光定量PCR的方法檢測(cè)RanBP9和CD320兩個(gè)基因組織相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示RanBP9和CD320在山羊的心、肝、脾、肺、腎、胰臟、肌肉、睪丸、卵巢和胸腺等組織中均有表達(dá)，其中RanBP9在睪丸中表達(dá)量最高，CD320在脾臟和睪丸組織中表達(dá)量較高。
　

10、　4.采集大足黑山羊和南江黃羊血液，樣本數(shù)均為30只，提取全血DNA，設(shè)計(jì)特異性引物，利用PCR-SSCP技術(shù)，研究CD320基因的遺傳多態(tài)性。結(jié)果顯示，大足黑山羊和南江黃羊CD320基因均檢測(cè)到AA、AB兩種基因型，大足黑山羊AA和AB基因型頻率分別為0.767和0.233，A、B基因頻率為0.883、0.117，He、Ne和PIC分別為0.207、0.667和0.333;南江黃羊AA和AB基因型頻率分別為和0.833和0.167，A