家蠶軀體發(fā)育突變Wes、Ecs-l和ap的分子解析及其基因調(diào)控研究.pdf

1、昆蟲的形態(tài)多樣性在其生存繁衍過程中占據(jù)著重要地位。昆蟲形態(tài)多樣性的產(chǎn)生是其適應(yīng)外部環(huán)境的需要，從本質(zhì)上講則是昆蟲軀體發(fā)育過程中基因差異表達(dá)的結(jié)果。隨著遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、分子生物學(xué)等生命科學(xué)的發(fā)展，人們?cè)絹碓蕉嗟膹姆肿铀缴辖沂纠ハx形態(tài)多樣性產(chǎn)生的根本原因。昆蟲軀體模式的建立是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，包含著不同層次的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控程序，其中同源異型基因（homeotic genes，Hox）的發(fā)現(xiàn)可以說是這一研究領(lǐng)域的里程碑。然而，Hox基因

2、作為昆蟲軀體模式發(fā)育的主調(diào)控基因，其重要性也暗示著調(diào)控作用機(jī)制的復(fù)雜性，除果蠅外，對(duì)其他昆蟲Hox基因的研究仍然較少，尤其是囊括了主要農(nóng)林害蟲的鱗翅目。同時(shí)，已有的研究表明軀體發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)和作用機(jī)制在不同昆蟲間存在著較大差異，說明了獨(dú)立研究代表性昆蟲的必然性與必要性。
　　家蠶作為鱗翅目的重要模式，擁有豐富的遺傳突變資源，又是遺傳學(xué)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，為形態(tài)發(fā)生的分子機(jī)制研究提供了良好的平臺(tái)。本研究以3個(gè)突變基因位點(diǎn)不同，但表

3、型相互聯(lián)系的家蠶E群及類似突變?yōu)橹饕芯坎牧希馕銎渫蛔兊姆肿踊A(chǔ)，并以此為切入點(diǎn)，鑒定參與家蠶軀體模式建立的有關(guān)重要基因，并對(duì)其相關(guān)功能進(jìn)行研究，通過3個(gè)突變之間的相互聯(lián)系，綜合研究相關(guān)基因在家蠶軀體發(fā)育過程中的作用及調(diào)控機(jī)制。獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.家蠶胸部突變Wes的分子解析及候選基因的功能研究
　　楔形眼紋（Wedge eye-spot，Wes）突變位于家蠶第6連鎖群24.3cM位點(diǎn)，為單基因顯性遺傳，其雜

4、合體（Wes/+Wes）幼蟲眼狀紋只有中間部分，并特化為狹窄的倒三角形，其名稱即由此而來。Wes突變純合體（Wes/ Wes）胚胎后期致死，其形態(tài)表現(xiàn)為胸節(jié)愈合，第1對(duì)胸足異位至頭部下方，并發(fā)生同源異型轉(zhuǎn)化為觸角形態(tài)，第2、3對(duì)胸足也均向觸角發(fā)生不同程度的轉(zhuǎn)化。Wes突變成蟲的前后翅表現(xiàn)為小翅或畸形翅。
　　利用244個(gè)BC1M個(gè)體對(duì)Wes突變位點(diǎn)進(jìn)行定位分析，將家蠶Wes突變的候選基因鎖定為BmAntp基因。經(jīng)克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在W

5、es突變體中BmAntp基因的第3外顯子內(nèi)部插入了1570bp的non-LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列，破壞了BmAntp基因的同源異型結(jié)構(gòu)域。此外，在Wes突變純合體中，發(fā)現(xiàn)BmAntp基因含有正常與突變兩種轉(zhuǎn)錄本，其中正常轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量明顯較低，而異常轉(zhuǎn)錄本則相對(duì)較高。我們推測(cè)Wes純合體突變表型的產(chǎn)生是由BmAntp基因功能的缺失導(dǎo)致的，其中正常轉(zhuǎn)錄本的量不足以維持其正常功能。與此相反，在Wes突變雜合體幼蟲中，BmAntp基因正常轉(zhuǎn)錄本

6、的表達(dá)量則顯著高于野生型中的表達(dá)量，表明Wes突變幼蟲的楔形眼紋表型可能是由BmAntp基因的過量表達(dá)所致。BmAntp基因正常轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量在突變中之所以升高，我們推測(cè)是因?yàn)锽mAntp基因的表達(dá)存在一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，而BmAntp蛋白功能的喪失破壞了這種平衡機(jī)制。綜上所述，研究結(jié)果表明BmAntp基因的精確表達(dá)是家蠶胸節(jié)發(fā)育所必需的。
　　對(duì)家蠶BmAntp基因的干涉結(jié)果顯示，在正常胚胎中一定程度沉默BmAntp基因后，胸節(jié)

7、發(fā)生愈合，胸足不能正常發(fā)育，這與Wes突變純合體胚胎的表型一致，暗示BmAntp基因在家蠶胸部分節(jié)過程中起著重要作用。在dsBmAntp-RNAi處理后的家蠶胚胎中出現(xiàn)胸足發(fā)育不全，結(jié)合Wes純合體中出現(xiàn)類觸角附肢，我們推測(cè)BmAntp基因既參與家蠶胸足的發(fā)育，同時(shí)也是胸足形態(tài)決定所必須的。此外，Wes突變成蟲的前后翅與野生型的相比表現(xiàn)為小翅或畸形翅，定量檢測(cè)結(jié)果顯示，BmAntp基因在突變前后翅中的表達(dá)量與野生型相比均有顯著升高，暗示

8、在家蠶中BmAntp基因可能參與翅的發(fā)育及形態(tài)形成。
　　2.家蠶腹部突變ECs-l的分子解析
　　家蠶ECs-l突變表現(xiàn)為第2腹節(jié)生過剩腹足，第3腹節(jié)生過剩半月紋，第5腹節(jié)星狀紋正常。由于家蠶E群突變(6-22.1cM)中的過剩半月紋過剩肢(supernumerary crescents and legs，ECs)突變除第5腹節(jié)缺星狀紋外，其余表型均與ECs-l突變相似，故而我們將該新突變命名為ECs-l（supernum

9、erary crescents andlegs-like）突變。
　　利用1605個(gè)BC1M個(gè)體對(duì)ECs-l突變基因進(jìn)行精細(xì)定位，我們將ECs-l突變位點(diǎn)鎖定在Bmabd-A和BmAbd-B基因間約68kb的區(qū)域。候選區(qū)域內(nèi)不含任何蛋白編碼基因，僅有一個(gè)非編碼RNA，miR-iab-4，但是通過對(duì)野生型大造和ECs-l突變中miR-iab-4序列的分析，并沒有發(fā)現(xiàn)二者之間存在核苷酸的變化。此外，在候選區(qū)域內(nèi)，我們共獲得9個(gè)多態(tài)性明

10、顯的標(biāo)記，且這些標(biāo)記在1605個(gè)定位群體中均與ECs-l位點(diǎn)共分離。利用18個(gè)家蠶地方品系對(duì)這9個(gè)多態(tài)標(biāo)記進(jìn)行特異性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，僅標(biāo)記P39在ECs-l突變中是特異的。標(biāo)記P39位于miR-iab-4上游約7.5kb處，通過對(duì)其擴(kuò)增的序列進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)與其他品系相比在ECs-l突變中有約210bp的缺失，且該序列在家蠶基因組中為單拷貝，也非轉(zhuǎn)座元件，我們推測(cè)該序列可能作為Bmabd-A基因或miR-iab-4的調(diào)控元件存在，在基因調(diào)控

11、中起著重要作用。
　　本研究中將ECs-l突變的候選區(qū)域定位在Bmabd-A基因上游約11kb處，因此將Bmabd-A基因作為ECs-l突變的候選基因進(jìn)行研究。對(duì)Bmabd-A基因mRNA與蛋白的表達(dá)分析結(jié)果均顯示其在ECs-l突變中顯著升高，對(duì)Bmabd-A基因的組織定位結(jié)果也表明Bmabd-A蛋白過量表達(dá)至A2體節(jié)，說明ECs-l突變中A2體節(jié)過剩肢的產(chǎn)生是由Bmabd-A基因的異位表達(dá)所致。因此，我們推測(cè)Bmabd-A基因可

12、以促進(jìn)家蠶腹足的形成與發(fā)育。
　　3.家蠶無胸足突變ap的基因定位研究
　　無胸足（apodal，ap）突變位于家蠶第3連鎖群22.3cM位點(diǎn)，表現(xiàn)為胸足退化，爬行、食桑困難，雌蛾不育。通過對(duì)ap突變雌蛾生殖系統(tǒng)的解剖，我們確定了導(dǎo)致其不育的原因?yàn)榻慌淠彝嘶瑫r(shí)通過對(duì)雌蛾造卵量的調(diào)查、卵孔觀察及孤雌生殖實(shí)驗(yàn)分別排除了雌蛾造卵能力、卵孔及卵內(nèi)容物方面存在的可能缺陷因素。由于ap突變雌蛾不育，我們選擇來自于F1代自交產(chǎn)生的F2

13、代中的ap突變個(gè)體用于基因定位。通過384個(gè)F2代ap突變個(gè)體的基因分型實(shí)驗(yàn)，我們將ap突變的候選區(qū)域鎖定在標(biāo)記A60和A73之間，與標(biāo)記A54和A85不發(fā)生交換，該區(qū)域內(nèi)有兩個(gè)預(yù)測(cè)基因BGIBMGA008843和BGIBMGA008844。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)基因?qū)嶋H上應(yīng)為一個(gè)基因，Bmsob基因。該基因?qū)儆趏dd skipped基因家族，參與一系列的胚胎發(fā)育及軀體模式建立過程。利用RACE技術(shù)我們獲得了Bmsob基因在野生型與ap突變

14、中的cDNA全長(zhǎng)序列，分別為1923bp和1924bp，其中蛋白質(zhì)編碼區(qū)長(zhǎng)1311bp，編碼436個(gè)氨基酸，5'非編碼區(qū)均長(zhǎng)85bp，3'非編碼區(qū)分別長(zhǎng)527bp和528bp，均有2個(gè)外顯子。在ORF框內(nèi)，Bmsob基因在野生型和ap突變中有15處單堿基突變，其中13個(gè)為同義突變，2個(gè)為錯(cuò)義突變(P→A，S→P)。另外，在ap突變中Bmsob基因的3'非編碼區(qū)有8處單堿基突變及1個(gè)堿基的插入。對(duì)Bmsob蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其是編碼含5個(gè)C

15、2H2型鋅指結(jié)構(gòu)的鋅指蛋白，屬于轉(zhuǎn)錄因子。
　　對(duì)家蠶sob基因的時(shí)空表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，Bmsob基因在家蠶幼蟲生殖腺中表達(dá)，在吐絲期第3天和蛹1天高量表達(dá)，這個(gè)時(shí)期是從幼蟲到蛹變態(tài)發(fā)育的關(guān)鍵階段，同時(shí)也是生殖腺發(fā)育的重要階段，暗示Bmsob基因在家蠶生殖腺的發(fā)育過程中起著重要作用。此外，對(duì)Bmsob基因在翅發(fā)育過程中的表達(dá)模式分析結(jié)果顯示，Bmsob基因的表達(dá)量隨著翅原基的發(fā)育，表達(dá)量逐漸增加，其中5齡末期表達(dá)量最高，暗示Bms

16、ob基因還參與了家蠶翅的發(fā)育與形成。通過qRT-PCR對(duì)Bmsob基因在胚胎期和蛹1天的表達(dá)量分析顯示，Bmsob基因在ap突變中的表達(dá)量與野生型中相比顯著降低，且近似于沉默。我們發(fā)現(xiàn)在野生型與突變中Bmsob基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在序列差異，并通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分別檢測(cè)了Bmsob基因在野生型與突變中的啟動(dòng)子活性，結(jié)果表明突變中Bmsob基因的啟動(dòng)子活性明顯降低，因此我們推測(cè)該基因啟動(dòng)子區(qū)域的序列變異可能是導(dǎo)致其表達(dá)量降低的重要原因。

17、
　　4.候選基因間的相互調(diào)控關(guān)系研究
　　根據(jù)對(duì)Wes和ECs-l突變的研究結(jié)果及Hox基因的功能，我們推測(cè)ap突變的三種突變表型（無胸足、畸形翅和交配囊退化）可能與家蠶Hox基因中的BmAntp、Bm Ubx和BmAbd-B基因有關(guān)。對(duì)這三個(gè)基因在野生型與ap突變中的表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果顯示，它們均上調(diào)表達(dá)。其中Wes突變與ap突變一樣，成蟲翅均表現(xiàn)為小翅或畸形翅，同時(shí)BmAntp基因也均表現(xiàn)為過量表達(dá)。因此，我們將Bmsob

18、作為調(diào)控Hox基因精確表達(dá)的上游基因進(jìn)行研究。
　　首先我們經(jīng)過原核表達(dá)且純化了Bmsob蛋白，通過EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Bmsob蛋白與BmAntp、 BmUbx和BmAbd-B基因的相互作用。結(jié)果表明，Bmsob蛋白能夠與BmUbx基因直接結(jié)合。繼之，為了驗(yàn)證Bmsob基因是否對(duì)Hox基因存在間接的調(diào)控作用，我們利用基因芯片對(duì)在野生型與ap突變中存在差異表達(dá)的基因進(jìn)行篩選，通過分析發(fā)現(xiàn)BmDsp基因可能在其中起著重要作用。通過EMS

19、A實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了Bmsob蛋白確實(shí)能夠與BmDsp基因結(jié)合。原核表達(dá)且純化BmDsp蛋白后，我們同時(shí)分析了BmDsp蛋白與BmPc、BmAntp、BmUbx和BmAbd-B基因的結(jié)合能力，結(jié)果表明BmDsp蛋白與它們均能夠結(jié)合。綜合以上結(jié)果，我們得出以下調(diào)控關(guān)系:BmDsp基因能夠促進(jìn)Hox基因的表達(dá)，Bmsob基因既能夠直接抑制Hox基因的表達(dá)，又能夠通過抑制BmDsp和BmPc等基因間接的抑制Hox基因的表達(dá)。我們推測(cè)該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在家蠶