家蠶淡體色(lbc)突變的分子機(jī)制初探.pdf

1、昆蟲(chóng)是一種分布十分廣泛的生物,從海洋、平原到山區(qū)都有它們的存在。不同的昆蟲(chóng)具有不同的生活習(xí)性與生理生態(tài)特征。多數(shù)為植食性,少數(shù)為肉食性。對(duì)于研究人員與收藏家來(lái)說(shuō)。昆蟲(chóng)多彩多樣的體色一直以來(lái)是他們關(guān)注的焦點(diǎn)。昆蟲(chóng)長(zhǎng)期以來(lái)一直是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的模式動(dòng)物。從摩爾根研究的果蠅到現(xiàn)在研究者廣泛使用的赤擬谷盜,昆蟲(chóng)對(duì)人們更好地了解與認(rèn)識(shí)自然功不可沒(méi)。
　　 家蠶是一種完全變態(tài)昆蟲(chóng),在中國(guó)已有5000多年的養(yǎng)殖與產(chǎn)絲歷史。家蠶作為生物模型為人們

2、所研究也已經(jīng)有一個(gè)多世紀(jì)的時(shí)間。家蠶是鱗翅目的模式昆蟲(chóng),在長(zhǎng)期研究過(guò)程中所保存下來(lái)的500多種突變體為科研人員研究基因功能與探索發(fā)育過(guò)程提供了良好的材料。體色突變?cè)诩倚Q所有突變中占有很大的比例。家蠶的體色主要由三大色素代謝路徑所決定:眼色素代謝路徑,蝶啶類(lèi)代謝路徑和黑色素代謝路徑。每一個(gè)色素代謝路徑都有多種突變體與之對(duì)應(yīng),而且不少突變體的突變基因已被克隆,包括:眼色素路徑中的w-3oe,w-2和re;蝶啶類(lèi)路徑中的lem;黑色素路徑中的

3、bts,ch,so,mln,sch等。一些其它色素也會(huì)影響昆蟲(chóng)的體色,如尿酸與類(lèi)胡蘿卜素。與之相關(guān)的被克隆的突變有:尿酸代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)及累積異常的oq,og,ow,os等突變;類(lèi)胡蘿卜素轉(zhuǎn)運(yùn)及累積異常的Y,C等.
　　 家蠶淡體色突變(lightbodycolor,lbc)是第5染色體的隱性突變,其表型為:突變體卵期與1齡表型正常。第1次蛻皮后全體變?yōu)榈?通過(guò)基因芯片篩查與連鎖分析,本研究篩選并克隆了lbc突變的的候選基因,同時(shí)分

4、析了突變基因的表達(dá)特征,并對(duì)該基因進(jìn)行了初步的功能研究。所取得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.基因芯片分析與lbc候選基因篩查
　　 lbc突變與野生型2齡幼蟲(chóng)的全蠶芯片數(shù)據(jù)對(duì)比分析結(jié)果顯示,在Dazao與lbc中表達(dá)差異明顯的基因共有677個(gè)。這些基因涉及轉(zhuǎn)運(yùn)、幾丁質(zhì)代謝、氨基酸代謝、肌肉發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程。進(jìn)一步的,結(jié)合lbc的表型,我們對(duì)差異基因的表達(dá)部位進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在表皮中明顯表達(dá)的基因共有16個(gè)。進(jìn)一步對(duì)此16

5、個(gè)基因的預(yù)測(cè)功能進(jìn)行分析。我們保留了其中的10個(gè)基因作為初步候選,并對(duì)此10個(gè)基因的CDS在Dazao與/bc中進(jìn)行了擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果顯示,其中的9個(gè)并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯差異,而有一個(gè)基因V在lbc突變中的擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度明顯大于野生型Dazao,結(jié)合芯片分析結(jié)果,我們將該基因初步確定為lbc突變的候選基因。
　　 2.V基因與lbc位點(diǎn)的連鎖分析
　　 我們根據(jù)預(yù)測(cè)的V基因的基因組序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)標(biāo)記:G1與G2。在定位群體的親

6、本Dazao與F2子代中具有l(wèi)bc表型的個(gè)體間進(jìn)行多態(tài)篩選。結(jié)果顯示,標(biāo)記G1,G2在Dazao與lbc表型的個(gè)體中均表現(xiàn)出多態(tài)性。利用F2群體中的125個(gè)lbc表型個(gè)體進(jìn)行分型分析,結(jié)果顯示,lbc突變座位與V基因間沒(méi)有發(fā)生重組,表明兩者緊密連鎖。同時(shí),為了進(jìn)一步確定V與lbc突變的關(guān)系,我們?cè)?3個(gè)不同的家蠶品系中擴(kuò)增了V基因的CDS序列。電泳結(jié)果表明,只有l(wèi)bc的條帶滯后,而其它12個(gè)品系帶型一致.
　　 3.Dazao與

7、lbc中V基因CDS的克隆與序列分析
　　 我們克隆了Dazao與lbc中V基因的CDS。序列分析后發(fā)現(xiàn)Dazao中的序列與SilkDB中的序列一致,但是在lbc突變體中發(fā)現(xiàn)了27bp的插入。在lbc序列中還存在6處單堿基替換。將正常與突變體序列翻譯為蛋白質(zhì)后發(fā)現(xiàn),6處單堿基替換并沒(méi)有造成氨基酸改變,但是27bp的核苷酸插入造成了lbc基因中9個(gè)氨基酸的插入。通過(guò)TMHMM在線(xiàn)預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)9個(gè)氨基酸的插入可能破壞lbc基因所編碼蛋

8、白的第3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。
　　 4.V基因在Dazao中的cDNA全長(zhǎng)克隆
　　 通過(guò)RACE技術(shù).我們克隆了Dazao的V的全長(zhǎng)與lbc中的3'UTR。序列拼接后發(fā)現(xiàn)該基因的cDNA全長(zhǎng)為693bp,5'UTR為67bp,3'UTR為110bp.并且,我們?cè)趌bc的3'UTR中發(fā)現(xiàn)了9bp的核苷酸插入。
　　 5.V基因的表達(dá)模式分析
　　 我們對(duì)V基因的時(shí)期與組織表達(dá)模式進(jìn)行了分析。組織表達(dá)譜結(jié)果顯示,

9、該基因在幼蟲(chóng)頭部,表皮與脂肪體中高表達(dá),而在其它組織中基本不表達(dá)。時(shí)期表達(dá)譜結(jié)果顯示,該基因在4齡起蠶、4齡第2天、5齡起蠶至5齡第5天和上蔟第4天表達(dá);在4齡2天至4齡眠、5齡第5天至化蛾(上蔟第4天除外)基本不表達(dá)。20E注射實(shí)驗(yàn)顯示:注射組V基因的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組,結(jié)果表明V基因的表達(dá)可能受到20E滴度的抑制。
　　 6.Bmlbc與黑色素代謝路徑關(guān)鍵基因的定量和氨基酸含量測(cè)定
　　 利用qRT-PCR技術(shù),我

10、們對(duì)Bmlbc基因與黑色素代謝路徑的關(guān)鍵基因PAH,TH,DDC和yellow進(jìn)行了定量分析。結(jié)果表明在lbc中,PAH,TH,DDC的表達(dá)量分別為Dazao中的3倍,30倍和2倍。但是,yellow的表達(dá)量在lbc與Dazao中并未表現(xiàn)出明顯區(qū)別。并且,在lbc突變體中,候選基因Bmlbc的表達(dá)量與Dazao中表達(dá)量相比下調(diào)了二十倍以上。Dazao與lbc中的氨基酸含量測(cè)定結(jié)果表明,lbc中苯丙氨酸與酪氨酸的含量都遠(yuǎn)高于Dazao,分