禾谷鐮刀菌磷脂酶C1基因的克隆與功能分析.pdf

1、小麥赤霉病是一種世界性的病害，它能造成包括大麥、小麥等禾谷類作物產(chǎn)量上極大的損失。小麥赤霉病主要發(fā)生在我國的中部和長江中下游流域，在長江中下游地區(qū)病害發(fā)生的頻率最高且程度最重。隨著耕作制度以及氣候的變化，小麥赤霉病有大規(guī)模嚴(yán)重發(fā)生的可能。研究表明，我國小麥赤霉病的流行范圍已經(jīng)開始向山東等北部省份轉(zhuǎn)移，山東省的小麥赤霉病主要優(yōu)勢種群為禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum），它是我國小麥赤霉病的主要病原物。F.gramine

2、arum產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素DON以及它的衍生物3-ADON和15-ADON極大的威脅人畜的生命健康并影響籽粒的食用價值，但是對禾谷鐮刀菌的產(chǎn)毒機理及致病機制的研究還相對較少。對磷脂酶C的研究發(fā)現(xiàn)它在磷脂信號途徑中扮演著非常重要的角色，它能催化細(xì)胞膜上一系列的合成與降解反應(yīng)。通過催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(phosphatidylinositol4，5-biphosphate，PIP2)水解產(chǎn)生二酯酰甘油(diacylglycer

3、ol，DAG)和三磷酸肌醇(trisphosphate inositol，IP3)。IP3能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣池中的Ca釋放出來，DAG則能夠直接激活鈣調(diào)蛋白介導(dǎo)激活的Ca2+依賴性蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)。磷脂酶C的典型結(jié)構(gòu)包括一個氮端PH結(jié)構(gòu)域、碳端的C2催化區(qū)、EF手型結(jié)構(gòu)域和高度保守的X區(qū)和Y區(qū)。目前已知真菌PLC都屬于PLCδ型。
　　本實驗以禾谷鐮刀菌（F.graminearum）菌株01-3

4、做為實驗材料，通過NCBI的Blast、Conserved Domain Search Genebank及DNAMAN等生物學(xué)網(wǎng)站和軟件對禾谷鐮刀菌基因組數(shù)據(jù)庫中的PLCs進(jìn)行了分析;并設(shè)計針對禾谷鐮刀菌PLC1基因的特異性引物，克隆得到FgPLC1基因;然后構(gòu)建了FgPLC1基因的敲除載體和回復(fù)載體，通過聚乙二醇介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法獲得了FgPLC1基因敲除突變體和回復(fù)突變體;通過對FgPLC1基因敲除突變體和回復(fù)突變體表型和毒素含

5、量進(jìn)行分析，明確了FgPLC1基因在禾谷鐮刀菌生長、產(chǎn)孢以及毒素合成等過程中的作用。所得結(jié)果如下：
　　⑴通過NCBI Blast功能找到了5個禾谷鐮刀菌PLC基因，確定了它們在染色體上的位置，各個基因所具有的結(jié)構(gòu)，然后將各個基因分別命名為PLC1、PLC2、PLC3、PLC4、PLC5。根據(jù)禾谷鐮刀菌PLC1基因序列設(shè)計特異性引物，克隆得到禾谷鐮刀菌PLC1基因(FgPLC1)。再通過NCBI Conserved Domain

6、Search比較分析，發(fā)現(xiàn)禾谷鐮刀菌PLC1的結(jié)構(gòu)與稻瘟病菌PLC1最為相似，都包含PH區(qū)，EF手型區(qū)、C2結(jié)構(gòu)域、X區(qū)和Y區(qū)。
　?、聘鶕?jù)禾谷鐮刀菌基因組序列設(shè)計引物，以質(zhì)粒pCB1003為基礎(chǔ)，以潮霉素抗性基因為遺傳標(biāo)記，通過Overlap技術(shù)連接基因敲除同源臂，構(gòu)建禾谷鐮刀菌PLC1基因敲除載體pMDa+b+H。制備了禾谷鐮刀菌野生型菌株原生質(zhì)體，用構(gòu)建好的敲除質(zhì)粒聚乙二醇介導(dǎo)轉(zhuǎn)化野生型菌株原生質(zhì)體，得到禾谷鐮刀菌PLC1基

7、因敲除轉(zhuǎn)化子，驗證正確后，確定得到禾谷鐮刀菌基因敲除突變體△FgPLC1。
　　⑶以質(zhì)粒pCB1532作為基礎(chǔ)，構(gòu)建了FgPLC1基因回復(fù)載體，以回復(fù)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化禾谷鐮刀菌基因敲除突變體原生質(zhì)體，篩選得到禾谷鐮刀菌PLC1基因回復(fù)轉(zhuǎn)化子，PCR和RT-PCR驗證正確后,確定得到禾谷鐮刀菌基因回復(fù)突變體△FgPLC1-C。
　?、韧ㄟ^對比野生型菌株和突變體菌株在生長、產(chǎn)孢、基因表達(dá)、毒素合成等方面的變化發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮刀菌PLC1

8、基因敲除突變體與野生型相比，氣生菌絲數(shù)量明顯減少，生長速率減慢，菌落顏色變淺;相對于野生型菌株，敲除突變體菌株在氯化鈉和剛果紅培養(yǎng)基上的生長均受到了抑制，抑制率分別為48.4％、28.2％。在加有過氧化氫的培養(yǎng)基上，敲除突變體菌株受到的抑制率相對于野生型變小，其抑制率為4.4％。與在PDA培養(yǎng)基上的生長相比，在山梨醇培養(yǎng)基上，野生型菌株的生長受到了促進(jìn)，敲除突變體的生長受到了抑制，抑制率為6.64％;分生孢子產(chǎn)量增大，敲除突變體菌株所產(chǎn)

9、分生孢子的數(shù)量約為野生型菌株的兩倍;此外敲除突變體分生孢子的長度和寬度均變小，分別比野生型菌株減少了82.5％和35.4％，敲除突變體不能像野生型菌株一樣產(chǎn)生正常的有性孢子;敲除突變體Tri5、Tri6基因的表達(dá)量也都降低，其中Tri5基因的表達(dá)量較野生型下降了78％，Tri6基因的表達(dá)量較野生型下降了97％; DON的產(chǎn)量也有所下降，敲除突變體菌株所產(chǎn)DON的含量比野生型菌株減少了76.5％?；貜?fù)PLC1基因后，這些敲除突變體所產(chǎn)生的