BmNPV-pif-1的序列分析及亞細胞定位分析.pdf

1、家蠶核型多角體病毒（BmNPV）基因組全長128kb，預(yù)測編碼136個ORF，BmNPV ORF97和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）ORF119(Ac119)為同源基因，已有研究表明Ac119是一個重要的口服感染因子，命名為pif-1。研究表明AcMNPV缺失了pif-1時，其包涵體來源病毒（ODV）就會失去口服感染性，但卻不影響芽生病毒粒子（BV）的感染性。而BmNPV ORF97（pif-1）的功能尚沒有研究。
　

2、　因此，本論文主要從BmNPV pif-15'-RACE序列分析、啟動子序列分析、抗體制備、pif-1基因的表達時相分析以及蛋白的細胞定位這幾方面來開展相關(guān)研究，為后期pif-1的深入研究奠定基礎(chǔ)。
　　1）pif-1序列分析：通過5'-RACE技術(shù)，克隆得到了BmNPV pif-1的5'上游序列（100bp左右），在5'上游序列可以看到病毒晚期啟動子的保守序列（A/T/G）TAAG。進一步對PIF-1編碼序列分析發(fā)現(xiàn)其含有2個R

3、GD基序。KSHV（加上全名）研究表明 RGD基序可以介導(dǎo)目的蛋白與整聯(lián)蛋白αVβ3結(jié)合，促使病毒粒子與靶細胞的融合。
　　2）PIF-1抗體制備：運用了原核表達系統(tǒng)成功表達了PIF-1蛋白。通過免疫新西蘭大白兔成功的得到了特異比較高的抗體，為后期蛋白互作及蛋白定位研究奠定基礎(chǔ)。
　　3）pif-1的轉(zhuǎn)錄時相分析：通過熒光定量PCR技術(shù)得到了pif-1的轉(zhuǎn)錄時相。在病毒的感染早期，主要是利用宿主的一些細胞元件和原料來合成自身

4、的蛋白，在晚期病毒粒子的組裝過程中一些功能性的蛋白開始大量的表達，以利于病毒的組裝和傳播。
　　4）pif-1亞細胞定位分析：利用瞬時表達系統(tǒng)，將pif-1與eGFP融合表達，通過激光共聚焦顯微鏡觀察熒光分布位置，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pif-1-eGFP熒光均勻分布于細胞質(zhì)中，而在病毒感染后，熒光進入細胞核中，表明pif-1在其它病毒因子參與下，被運輸至細胞核中，并在其中被裝配到核衣殼中，形成成熟的ODV粒子。
　　通過以上的研究和分析