山核桃RCA基因克隆、表達(dá)及其在抗高溫中的作用.pdf

1、山核桃(Carya cathayensis Sarg.)是重要的木本油料作物，生產(chǎn)中易受到自然逆境脅迫因素影響，尤其是高溫，高溫下嚴(yán)重限制植物光合作用致使山核桃生長(zhǎng)，結(jié)實(shí)，有機(jī)物積累等都受到影響。因此，對(duì)山核桃光合作用相關(guān)基因的開(kāi)發(fā)和利用具有重要的意義。在高等植物中光合作用關(guān)鍵步驟固定CO2過(guò)程需要Rubisco酶的催化，Rubisco酶的活性由植物體內(nèi)復(fù)雜的機(jī)制進(jìn)行調(diào)控，其中大量研究已證實(shí)Rubisco activase（RCA）能夠

2、活化并維持Rubisco酶的催化活性。同時(shí)RCA也被認(rèn)為是植物在各種不同環(huán)境脅迫下對(duì)光合作用的關(guān)鍵調(diào)控因素。因此，Rubisco活化酶的功能研究對(duì)于增強(qiáng)植物體內(nèi)Rubisco酶活性穩(wěn)定光合作用系統(tǒng)，進(jìn)而提高植物適應(yīng)逆境的能力具有重要作用。
　　本試驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用RACE技術(shù)，克隆得到了山核桃2個(gè)RCA基因的全長(zhǎng)cDNA序列，命名為CcRCAα和CcRCAβ。序列開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度分別為1419bp、1302bp，推測(cè)編碼472和433個(gè)氨

3、基酸。利用DNAMAN軟件對(duì)山核桃RCA基因與葡萄等物種的RCA氨基酸序列進(jìn)行的多重序列比對(duì)，結(jié)果表明，兩者氨基酸序列相似性很高，且與葡萄等物種的RCA序列同源性高達(dá)87％以上。本試驗(yàn)還得到了山核桃另一個(gè)RCA基因cDNA序列，命名為CcRCAβ2，分析表明，其氨基酸序列與CcRCAβ的相似性高達(dá)96%以上，同屬于β類型RCA基因。
　　此外，本文以pET28a+載體為表達(dá)載體，構(gòu)建了載有山核桃CcRCAα的原核表達(dá)載體，通過(guò)IP

4、TG法誘導(dǎo)BL21(DE3)表達(dá)菌株表達(dá)具有可溶性的RCA異源蛋白，并經(jīng)條件優(yōu)化得到原核表達(dá)的最適條件：培養(yǎng)基體積20ml中加入終濃度1mM的IPTG經(jīng)28℃誘導(dǎo)4-6小時(shí)。為進(jìn)一步研究山核桃RCA基因的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　本文還對(duì)山核桃RCA基因在高溫脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，高溫下山核桃光合速率、Rubisco酶活力及RCA基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平呈下降趨勢(shì)，高溫抑制山核桃光合作用，可能通過(guò)影響RCA基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯進(jìn)