雞miR-1666前體區(qū)SNP對(duì)其成熟體生成和其靶基因調(diào)控的影響.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是近年來(lái)鑒定的具有重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能的非編碼RNA，由于每個(gè)miRNA的靶基因眾多，而位于miRNA基因上的單核甘酸多態(tài)性(Single NucleotidePolymorphisms，SNP)能夠改變其加工過(guò)程或其對(duì)靶基因的選擇進(jìn)而影響該miRNA功能的發(fā)揮，因此鑒定與揭示miRNA SNPs的功能與作用顯得尤為重要。本研究的主要目的是探究位于miR-1666前體區(qū)的SNP是否影響miRNA成熟體的生成，

2、揭示miR-1666的生物學(xué)功能以及該SNP對(duì)miR-1666功能的影響。該研究用生物信息學(xué)方法篩選出雞miR-1666前體區(qū)存在的SNP，以河南省家禽種質(zhì)資源創(chuàng)新工程研究中心構(gòu)建的固始雞-安卡雞F2代資源群為研究材料，DNA測(cè)序和PCR-RFLP的方法鑒定出位于資源群miR-1666基因的SNP并進(jìn)行基因分型，與資源群的肉質(zhì)性狀、生長(zhǎng)性狀、屠體性狀等經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析初步揭示該SNP的功能;通過(guò)構(gòu)建miR-1666不同等位基因的pE

3、G FP-N1表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，用熒光定量的方法檢測(cè)該SNP對(duì)成熟miRNA生成的影響;用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)合熒光定量的方法鑒定和驗(yàn)證miR-1666的靶基因，并探究該SNP對(duì)miR-1666靶基因調(diào)控的影響。本研究主要得到以下結(jié)果:
　　1.生物信息學(xué)結(jié)合測(cè)序鑒定的方法在固始雞和安卡雞F2代資源群中檢測(cè)到唯一一個(gè)位于miR-1666前體區(qū)上的突變位點(diǎn)即rs14120863(C/G)。與F2代資源群經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)分析表明，

4、該SNP與雞的半凈膛重、全凈膛重、胸肌重、腿肌重及部分體尺性狀包括脛圍、胸深、胸骨長(zhǎng)和體斜長(zhǎng)存在顯著關(guān)聯(lián)，且CC型個(gè)體顯著優(yōu)于GG型。
　　2.M-fold軟件預(yù)測(cè)顯示該SNP能夠引起堿基的錯(cuò)配進(jìn)而產(chǎn)生一個(gè)新的凸起且該SNP改變了miR-1666二級(jí)結(jié)構(gòu)的最低自由能，自由能由G等位基因的-37.5kcal/mol改變?yōu)镃等位基因的-35.2kcal/mol，二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性降低。熒光定量結(jié)果顯示固始-安卡雞F2代資源群中GG基因型

5、個(gè)體胸肌組織樣中成熟miR-1666的表達(dá)量顯著高于CC基因型;通過(guò)構(gòu)建miR-1666不同等位基因的pEGFP-N1表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，熒光定量檢測(cè)表明G等位基因成熟miR-1666的表達(dá)顯著高于C等位基因，與上述結(jié)果相符。結(jié)果表明miR-1666前體區(qū)的rs14120863 SNP能夠影響成熟miR-1666的生成。
　　3.生物信息學(xué)的方法結(jié)合熒光定量技術(shù)篩選出ARF6, CBFB和TAB2為miR-1666的候選靶基

6、因，進(jìn)而通過(guò)構(gòu)建上述三個(gè)基因的psi-Check2雙熒光素酶報(bào)告載體，確定CBFB為miR-1666的一個(gè)靶基因，而ARF6和TAB2并非其靶基因。最終通過(guò)熒光定量檢測(cè)miR-1666不同等位基因?qū)Π谢駽BFB的調(diào)控作用，結(jié)果顯示該SNP能夠影響miR-1666對(duì)CBFB的調(diào)控能力。由以上試驗(yàn)結(jié)果，可得出如下結(jié)論:
　　MiR-1666前體區(qū)的SNP能夠改變成熟miR-1666的表達(dá)量，進(jìn)而影響miR-1666對(duì)靶基因CBFB的